DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分。实验目的是学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将BAC克隆所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到pUC18载体上。

实验方法原理        

 

限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。

实验材料         

DNA片段PUC18

试剂、试剂盒      

   

R.Ebuffer水凝胶氯仿 异戊醇乙醇

仪器、耗材    

离心机

实验步骤   

     

1.  载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：

50 μl反应体系，用1.5ml tube，冰上操作）

DNA           30 μl

R.E           1 μl

10×buffer        5 μl

ddH2O           14 μl

 

外源片段酶切产物和5 μl 37 ℃反应1hr，分别取8 μl  PUC18酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全；按2－5步纯化、回收DNA

 

2.  加入ddH2O 150  （扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000 g离心10 min；

 

3.  吸取上清，加1/10体积3 M NaAc和两倍体积无水乙醇，-20 ℃放置15分钟以上；

 

4.  12000 g 4 ℃冷冻离心15分钟；

 

5.  ddH2O（1.5 ml ddH2O（0.5 ml tube中），PUC18溶于20 μl 倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10  tube中）；

6.  按以下反应去除载体PUC18的5’磷酸基团，50 ℃反应30 min 以上

DNA                   20 μl

CIAP（TaKaRa）        0.5 μl

buffer              4.0 ´10 μl

ddH2O               15.5 μl

 

7.  70 ℃水浴10 min, 使CIAP失活；

 

8.  按2－5步纯化载体，溶于10 μl ddH2O；

 

9.  连接反应

DNA                10 μl

pUC18            2.5 μl

buffer           1.5 ´5 μl

mT4 ligase   3 U/μl

 

16 ℃水浴过夜

 

10.  转化大肠杆菌感受态细胞

 

11.  转化子的鉴定

此文转载来源：丁香通