FISH和PRINS技术3
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2017-11-01
二、用引物介导的原位标记（PRINS）
是PCR和荧光原位杂交（FISH）的结合， PRINS是由未标记的序列特异性寡核苷酸探针与固定在细胞内的靶DNA互补序列，在聚合酶的驱动下，带有标记的脱氧核苷酸（FITC-dUTP或半抗原-dUTP）和dATP、dCTP、dGTP的延伸，依赖标记，新合成的DNA就能直接的或间接的带有FITC，用荧光显微镜观察。
PRINS实验步骤
1. 常规脱蜡浸入0.01 mol/L PBS；
2. 用0.2 mol/L 盐酸处理5min；
3. 蛋白酶K（25 μg/ml）消化37℃ 15 min；
4. 分别用80%，95%和100%酒精脱水，室温干片；
5. 加PCR混合液25 μL（10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，各加200 μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5 mmol/L dig-11-dUTP 1.5 μl，引物250 ng，Taq DNA聚合酶2 U），加盖片；
6. 94℃变性5 min后置入65℃湿盒中5 min；
7. 用0.1×SSC液，65℃洗5 min；
8. 片于65℃ 10~20 s；用4×SSC-0.1%吐温20液42℃洗5 min，2次；
9. 经Buffer 1液洗后滴加20%羊血清封闭30 min；
10. 加地高辛抗体复合物（1：500）室温下2 h；
11. BufferⅢ液洗5 min；
12. 用BCIP-NBT显色1~2 h，在镜下控制，终止显色；
是PCR和荧光原位杂交（FISH）的结合， PRINS是由未标记的序列特异性寡核苷酸探针与固定在细胞内的靶DNA互补序列，在聚合酶的驱动下，带有标记的脱氧核苷酸（FITC-dUTP或半抗原-dUTP）和dATP、dCTP、dGTP的延伸，依赖标记，新合成的DNA就能直接的或间接的带有FITC，用荧光显微镜观察。
PRINS实验步骤
1. 常规脱蜡浸入0.01 mol/L PBS；
2. 用0.2 mol/L 盐酸处理5min；
3. 蛋白酶K（25 μg/ml）消化37℃ 15 min；
4. 分别用80%，95%和100%酒精脱水，室温干片；
5. 加PCR混合液25 μL（10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，各加200 μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5 mmol/L dig-11-dUTP 1.5 μl，引物250 ng，Taq DNA聚合酶2 U），加盖片；
6. 94℃变性5 min后置入65℃湿盒中5 min；
7. 用0.1×SSC液，65℃洗5 min；
8. 片于65℃ 10~20 s；用4×SSC-0.1%吐温20液42℃洗5 min，2次；
9. 经Buffer 1液洗后滴加20%羊血清封闭30 min；
10. 加地高辛抗体复合物（1：500）室温下2 h；
11. BufferⅢ液洗5 min；
12. 用BCIP-NBT显色1~2 h，在镜下控制，终止显色；
13. 用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。（转帖）
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