这种方法源自于对 Chirgwin 等（1979) 所拟方案的修改。对 Chirgwin 等所规定的试剂，许多试剂盒中常用，且用于分离和纯化 RNA 的试剂也是常见的。

实验材料         

细胞和组织

试剂、试剂盒        

 

氯仿氯化铯溶液二硫苏糖醇EDTA乙醇异硫氰酸胍裂解缓冲液异丙醇N-月桂酰肌氨酸氯化锂液氮β-巯基乙醇苯酚

仪器、耗材     

离心机和转子研钵和杵超速离心管

实验步骤 

       

一、材料

 

1. 缓冲液、溶液和试剂

 

氯仿

 

氯化铯溶液，5.7mol/L(5.7mol/L 氯化铯，25 mmol/L 醋酸钠，pH6.0，1mmol/LEDTA,pH8.0)

 

用焦碳酸二乙酯（DEPC) 处理过的水

 

二硫苏糖醇（DTT)，0.2 mmol/L

 

EDTA,1mmol/L，pH8.0

 

乙醇，70%(体积分数）

 

异硫氰酸胍裂解缓冲液 (4mol/L 异硫氰酸胍，25 mmol/L 醋酸钠，pH6.0,1mmol/LEDTA,pH8.0)

 

异丙醇

 

N-月桂酰肌氨酸，20%（200 g/L)

氯化锂（LiCl),8mol/L

 

液氮

 

β-巯基乙醇,10 ml/L

 

苯酚, 水饱和，pH4.0

 

2. 离心机和转子

 

BeckmanTi50 转子或相当的转子

 

3. 特殊设备

 

研钵和杵，用 DEPC 处理过的水洗涤，预冷

 

超速离心管（异质同晶共聚材料），或相当的 Polygon, 或相当的高速匀浆器

 

4. 细胞和组织

 

细胞/组织，冻于液氮

 

二、方法

 

1. 使用研钵和杵在液氮下将样品研磨成细粉。使用 Polygon 均化器或其他合适的器具在 7 ml 胍裂解缓冲液中均质化组织或细胞（达 1X109 个）。

 

2. 将 4 ml5.7mol/L 的 CsCl 溶液加到超速离心管中。

 

3. 将 1ml5.7mol/L 的 CsCl 溶液、120ul10mol/L 的沒-巯基乙醇和 240ulN-月桂酰肌氨酸加到裂解产物中。

4. 将氯化铯/裂解产物混合物混合，小心使之位于离心管中的氯化铯溶液上分层。

 

5.20°C 下 180000 g 离心 21 h。

 

6. 移弃氯化铯上清液，小心避免扰动管底的 RNA 沉降物。

 

7. 小心将 RNA 沉降物再溶解于 750ul 异硫氰酸胍裂解缓冲液中。

 

8. 加等体积酚，混匀。

 

9.10000g 离心 15 min。

 

10. 将水相转移到一新管中。重复水相的酚抽提，直到界面变清。

 

11. 向清澈的水相加 1 倍体积氯仿。

 

12. 混合，l0000 g 离心 l0 min。

 

13. 将水相转移到一干净试管中。加等体积的异丙酵和 1/10 体积 8mol/L 的氯化锂。10000g 离心10min。

 

14. 移弃上清液。用 750ul70% 乙醇洗涤 RNA 沉降物，10000 g 离心。

 

15. 移弃乙酵，风干沉降物，再溶解于 50~500ul0.2 mmol/L 的 DTT 中。

 

16.RNA 储存于-70°C。

此文转载来源：丁香通