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从石蜡包埋固定的组织中制备 RNA 实验

该方案是由 Godfrey 等改进 Fisher 的方案发表的。此前已有从固定组织中纯化 RNA 的方案发表。Ambion Roche 发明了从石蜡包埋的组织中纯化 RNA 的商品化试剂盒。


实验材料     

    

石蜡包埋的组织样品


试剂、试剂盒         


甲酰胺消化缓冲液乙醇肝糖异丙醇苯酚 氯仿蛋白酶 KTrizol二甲苯


仪器、耗材    

 

微量离心管恒温箱


实验步骤   

     

一、材料

 

1. 缓冲液、溶液和试剂

 

去离子化的甲酰胺

 

焦碳酸二乙酯(DEPC) 处理过的水

 

消化缓冲液(lmol/L 异硫氰酸胍,25 mmol/Lβ-巯基乙醇,0.5%N-月桂酰肌氨酸,20 mmol/LTris-HClpH7.5)

 

乙醇,100% 70%

 

肝糖

 

异丙醇

 

苯酚 (pH4.3): 氯仿(70%:30%)

 

蛋白酶 K(60 mg/ml20U/mg)

 

Trizol(Invitrogen)

 

二甲苯


2. 特殊设备

 

微量离心管,2 ml, RNA

 

恒温箱,预调至 37°C

 

水浴或恒温箱,预调至 55°C

 

3. 细胞和组织

 

石蜡包埋的组织样品,切割为 5~50 5um 厚的切片

 

二、方法

 

1. 将组织块置于 2.0 ml 微量离心管中,向样品中加 1.8 ml 二甲苯。37°C 温育 20 min

 

2. 稍微地离心样品,移弃上清液再加入二甲苯,重复温育和离心步骤。

 

3. 0.5 ml 乙酵洗涤组织。移弃乙醇,风干。

 

4. 80ul 蛋白酶 K(60 mg/ml20U/mg) 72ul 消化缓冲液。55°C 下振荡温育过夜。

 

5. 再次加 80ul 蛋白酶 K55°C 下振荡温育过夜。次日再次加 80ul 蛋白酶 K, 再次 55°C下振荡温育过夜。

 

6. 加等体积酚:氯仿,混合,在微量离心机中以最大转速离心 5 min。将液相转移到RNA 酶的新管中。

 

7. 加等体积异丙醇和 2ug 肝糖,-20°C 放置 30 min


8. 在微董离心机中以最大转速离心 30 min。移弃上清液,用 70% 乙酵洗涤沉降物。

 

9. 在微量离心机中以最大转速离心 30 min 并移弃上清液。风干沉降物,将之再溶解20ulDEPC 处理过的水中。加 500ulTrizol。遵循 Trizol 方案(见本章方案 3),对一处做修改:在第一次 Trizol 处理后,将液相转移到无 RNA 酶的新管中,用 500ulTrizol 第二次处理样品。

 

10. 向第二次 Trizol 处理过的液相加 500ul 异丙醇以沉淀 RNA

 

11. RNA 沉降物再溶解于 20ul 去离子甲酰胺中。-20°C 储存 RNA




此文转载来源:丁香通

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