聚合酶链式反应(PCR)2
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2018-06-25
实验材料 模板DNA
试剂、试剂盒 dNTPTaq DNA聚合酶蒸馏水PCR缓冲液引物氯化镁
仪器、耗材 PCR仪移液枪PCR板薄壁管离心管离心管盒
实验步骤
一、标准的PCR反应体系
10×扩增缓冲液 10 ul
4种dNTP混合物 各200 umol/L
引物 各10～100 pmol
模板DNA 0.1～2 ug
Taq DNA聚合酶 2.5 u
Mg2+ 1.5 mmol/L
加双或三蒸水至 100 ul
二、PCR引物设计
PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
1. 引物设计的基本原则
（1） 引物长度：15-30 bp，常用为20 bp左右。
（2） 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
（3） 引物内部不应出现互补序列。
（4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。
（5） 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
（6）引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。
（7） 引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。
2. 引物设计软件
Primer Premier5.0 （自动搜索）*、Oligo6 （引物评价）、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 （在线服务）。
三、模板的制备
（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。
（2）模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。
（3）标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。
四、PCR反应条件的控制
1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。
2. 镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。
3. 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。
5. 引物 浓度一般为0.1 ～0.5 umol/L。
6. 反应温度
（1）变性温度和时间95℃，30 s。
（2）退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
（3）延伸温度和时间72℃，1 min/kb(10 kb内）。
（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)
7. 循环次数 ：一般为25 ～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
五、PCR的循环参数
1. 预变性（Initial denaturation）
模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
2. 循环中的变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
3. 引物退火（Primer annealing）
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略
延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。
5. 循环数
大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。
6. 最后延伸
在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
六、PCR步骤
1. DNA变性
（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA。
2. 退火
（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3. 延伸
（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。
七、PCR检测
PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。
试剂、试剂盒 dNTPTaq DNA聚合酶蒸馏水PCR缓冲液引物氯化镁
仪器、耗材 PCR仪移液枪PCR板薄壁管离心管离心管盒
实验步骤
一、标准的PCR反应体系
10×扩增缓冲液 10 ul
4种dNTP混合物 各200 umol/L
引物 各10～100 pmol
模板DNA 0.1～2 ug
Taq DNA聚合酶 2.5 u
Mg2+ 1.5 mmol/L
加双或三蒸水至 100 ul
二、PCR引物设计
PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
1. 引物设计的基本原则
（1） 引物长度：15-30 bp，常用为20 bp左右。
（2） 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
（3） 引物内部不应出现互补序列。
（4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。
（5） 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
（6）引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。
（7） 引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。
2. 引物设计软件
Primer Premier5.0 （自动搜索）*、Oligo6 （引物评价）、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 （在线服务）。
三、模板的制备
（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。
（2）模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。
（3）标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。
四、PCR反应条件的控制
1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。
2. 镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。
3. 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。
5. 引物 浓度一般为0.1 ～0.5 umol/L。
6. 反应温度
（1）变性温度和时间95℃，30 s。
（2）退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
（3）延伸温度和时间72℃，1 min/kb(10 kb内）。
（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)
7. 循环次数 ：一般为25 ～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
五、PCR的循环参数
1. 预变性（Initial denaturation）
模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
2. 循环中的变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
3. 引物退火（Primer annealing）
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略
延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。
5. 循环数
大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。
6. 最后延伸
在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
六、PCR步骤
1. DNA变性
（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA。
2. 退火
（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3. 延伸
（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。
七、PCR检测
PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。
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