试剂、试剂盒     

磷酸盐缓冲液Affi-Gel 10 磷酸钠（50 mmul L）乙醇胺

实验步骤       

材料

磷酸盐缓冲液（50 mmol/L;PH7.5~8,0)

Affi-Gel 10(Bio-Rad Laboratories)

磷酸钠（50 mmul/L），含 NaCl(1mol/L)(PBS)

乙醇胺（100 mmol/L)

操作程序

1) 用 50 mml/L 磷酸缓冲液（pH7.5~8.0) 配制 1~10 mg/ml 的蛋白质（配体) 溶液。此蛋白制备液必须不含其他氨基化合物。因此. 不应用 Tris 缓冲液或含铵盐的缓冲液。可用的缓冲液有磷酸缓冲液、MES、MOPS 和 HEPES 等。如果蛋白制备液含有其他氨基化合物，可用 0.5mol/L 磷酸缓冲液（pH7.5~8.0) 将其透析掉。留取少量蛋白样品，供测定偶联效率用。

2)Affi-Gel 10 胶是以异丙醇悬液供应的。使用时必须将异丙醉去掉，以免引起配体蛋白失活。将 Affi-Gel 10 悬液倾入一烧结玻板漏斗。4°C 下，用去离子水快速洗胶数次。不要让胶干了。如胶干掉，陷入微球内部的气泡会使某些连接位点（linking site) 失效。

3) 将洗过的 Affi-Gel10 微球加入蛋白溶液（每 0.5 ml 配体溶液约加 1 ml 微球)。室温下在摇床上轻轻混合过夜。

4) 过滤分离微球。保留滤液。测定滤液及步骤 1 留样的蛋白浓度，以计算偶联效率。蛋白浓度可用几种方法测定。如果用 OD280 测定蛋白浓度，则必须加入 0.1mol/LHCl, 使溶液 pH 降至 6.0 以下。否则，偶联时释出的 N-羟基琥珀酰亚胺在中性或高 pH 条件下会于 280nm 处有吸收。偶联效率只影响胶的容量。

5) 用磷酸缓冲盐溶液（PBS) 冲洗微球 。

6) 将微球置 100 mmot/L 乙醇胺中孵育 4 h 或过夜，以封闭剩余的反应性位点。

7) 用 FBS 冲洗微球。至此，亲和介质已可使用。

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