M13模板

实验材料         

mRNA

试剂、试剂盒         

琼脂糖电泳缓冲液ATP寡聚核苷酸引物多核苷酸激酶缓冲液T4

仪器、耗材     

离心机分光光度计摇床

实验步骤    

    

一、图片简介

二、实验步骤

 

1.  用1×碱性制胶缓冲液制备1.2%的低融点琼脂糖，并将凝固好的胶在1×碱性电泳缓冲液中浸泡过夜。

 

2.  将以下试剂混合以制备磷酰化的寡聚核苷酸：

 

（1）20 μl   ［γ-32P］ATP（10 mCi/ml，共200 μCi）

 

（2）1 μl  100 μg/ml 寡聚核苷酸引物

 

（3）25 μl  10×多核苷酸激酶缓冲液

 

（4）4 U  T4多核苷酸激酶

 

（5）30℃反应30 min 后，65℃加热5 min 灭火激酶。

 

3.  将溶于55 μl 水的18 μg 单链模板DNA和9 μl 10×TM缓冲液加入已磷酸化的寡聚核苷酸中，40℃杂交15 min。

 

4.  加入9 μl 4 mmol/l dNTP混合液和2 μl klenow酶，37℃保温30 min 以延伸寡核苷酸模板，65℃加热5 min 灭活klenow酶后置于冰浴。

 

5.  加入10 μl 10×限制酶缓冲液和40 U 限制性内切酶，37℃保温45 min 切割探针，65℃加热5 min 灭活限制酶。

 

6.  加入100 μl 5mol/l 乙酸铵和500 μl 乙醇，-20℃沉淀过夜或干冰/乙醇中放置15 min，在微量离心机中离心15 min，晾干沉淀。

 

7.  将沉淀物重溶于25 μl 碱性加样缓冲液。加样并在最大电压降为1.8 V/cm 下电泳4 h。

8.  疑胶用X光感光片曝光5 min，冲洗感光片，对比凝胶和感光片，切下探针所在处的凝胶。

 

9.  将切下的凝胶移入一个微量离心管中，65℃融化，确定体积后，加入等体积的TE缓冲液，再在65℃保温10 min。

 

10.  加入1 μl 10 mg/ml tRNA和缓冲液平衡酚抽提2次后（不要用酚/氯仿），加入0.1体积的3 mol/l pH5.2的乙酸钠缓冲液及2倍体积无水乙醇沉淀。

 

11.  沉淀用100 μl 0.3 mol/l乙酸钠重溶，取1 μl 进行切伦科夫计数。

 

12.  在不多于50 μg RNA中加入5×104切伦科夫计数的探针，调整最终体枳为100 μl，盐浓度为0.3 mol/l 乙酸钠，加入250 μl 乙醇沉淀。

 

13.  以70%乙醇/30%DEPC处理过的水冲冼，并倒扣在Kimwipes纸上晾干30 min。

 

14.  重溶沉淀于20 μl S1杂交液，65℃变性10 min，30%杂交过夜。

 

15.  每个反应中加入以下S1核酸酶反应混合物：

 

（1）150 μl  2×S1核算酶缓冲液

 

（2）3 μl  2 mg/ml单链小牛胸腺DNA

 

（3）147 μl  水

 

（4）300 U  S1核酸酶

 

（5）60℃反应30 min，加80 μl S1终止缓冲液以终止反应。

 

16.  加1 ml 无水乙醇，沉淀。以70%乙醇冼沉淀，在Speedvac蒸发器中干燥5 min。

17.  重溶于3 μl TE缓冲液和4 μl 甲酰胺加样缓冲液，煮沸3 min后，置于冰上。

 

18. 按下面的提示制备合适浓度的聚丙烯酰胺/尿素凝胶。

19.  在凝胶上加样3~5 μl 进行分析，凝胶放射自显影后确定标记DNA片段的大小。

来源：丁香通