通过 DEAE 纤维素柱纯化，除去少量 DNA、大分子 RNA、蛋白质、多糖等杂质，最后得到各种氨基酸专一性 tRNA 的混合物.

苯酚法制备酵母tRNA

试剂、试剂盒        

 

DEAE 纤维素 二乙醇胺 (TEA) 溶液 0.lmol LTEA 缓冲液 0.lmol L 氯化钠含 0.lmoi. LTEA 缓冲液 12mol L 氯化钠含 0.lmol LTEA 缓冲液 lmol L 氯化钠含 0.lmol LTEA 缓冲液 乙醚 水饱和酚 乙醇

仪器、耗材     

皂土电动搅拌器 离心机 部分收集器 紫外分光光度计

实验步骤        

一 材料与设备

 

1)DEAE 纤维素：称取 20 g 交换量 l.Ommol/gDEAE 纤维素，先用 300 ml0.5mol/L 氢氧化钠浸泡 1〜2 h 搅拌, 倾去上清液后水洗至中性。

 

2) 二乙醇胺 (TEA) 溶液：先用浓 HC1 调至 pH7.4, 然后稀释成 lmol/L 作为储液。

 

3)0.lmol/LTEA 缓冲液 (pH7.4)

 

4)0.lmol/L 氯化钠含 0.lmoi./LTEA 缓冲液，pH7.4,

 

5)12mol/L 氯化钠含 0.lmol/LTEA 缓冲液，pH7.4。

 

6)lmol/L 氯化钠含 0.lmol/LTEA 缓冲液，pH7.4。

 

7) 乙醚。

 

8) 水饱和酚。

 

9) 乙醇，

10) 皂土

 

11) 电动搅拌器。

 

12) 离心机，

 

13) 部分收集器。

 

14) 紫外分光光度计。

 

 

二 操作方法

 

1)250 g 新鲜面包酵母，加入 375 ml 蒸馏水，搅匀成糊状。

 

2) 再加入 500 ml90% 苯酚（改变细胞透性，使蛋白变性），电动搅拌 lh 后，放置于冰箱中过夜。

 

3)4000r/min 离心 15 min, 弃去上清液，下层为酚相，小心吸出后 (避免吸入蛋白质），每升加 20 g 乙酸钾和 2L 乙醇使 tRNA 沉淀，-20°C 过夜。

 

4)4000r/nin 离心 15 min。弃去上清液，沉淀用 95% 乙醇洗一次，4000r./min 离心15 min

 

5) 沉淀再用乙醚洗一次，4000r/min 离心 15 min

 

6) 沉淀溶于 25 ml0.1mol/LTEA 缓冲液中. 加入 0.025 g 皂土，1.5 g 氯化钠，0°C 静置 lh，4000r/min 离心 15 min。

 

7) 上清液用 0.1mol/I.TEA 缓冲液稀释 10 倍，上样到已用的含 0.lmol/LNaCl 的0.lmol/LTEA 缓冲液平衡的 DEAE 纤维素柱. 用含 0.2mol/LNaCl 的 TEA 洗涤，至流出液的 OD260<0.05 为止。

8) 用含 1mol/LMaCl 的 TEA 洗脱，分部分收集, 测定其 OD260，取其峰值部分的液体

 

9) 加 2 倍体积 95% 乙醇，一 20℃ 过夜（或 2 h)

 

10)4000r/min 离心 15 min。上清液弃去，沉淀以 67% 乙醇，95% 乙醇，无水乙醇及乙醚各洗一次。

 

11)4000r/mim 离心, 沉淀真空干燥，电泳检测 tRNA,

来源：丁香通