S1核酸酶保护实验
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2017-03-09
一、材料准备
4μL5X T4激酶缓冲液
5 μl [γ-32P] ATP（7000次/毫摩尔）
10 μl 水+寡核苷酸（200毫微克）
1 μl T4激酶
1. 37摄氏度1小时
2. 热失活，在75℃下10分钟。
3. 加入1 μl 糖原（20毫克/毫升），2 μl 4M乙酸铵，90 μl 的乙醇。
4. 重悬沉淀，26 μl 水，并加入26 μl 4M醋酸铵，110 μl 乙醇。
5. 重悬沉淀，在5 μl 的水混合。
二、实验步骤
PCR产生的单链DNA探针 20 μl 消化的质粒（切5 μg 质粒的体积为20 μl）5 μl 标记的寡核苷酸10 μl 10X Taq缓冲液6 μl 25 mM MgCl2的10 μl DMSO 2 μl 10 mM 的dNTP 1μL Taq DNA聚合酶的PCR 14个循环运行在6%至8%聚丙烯酰胺/尿素凝胶切出探头和洗脱S1映射 。
1. 共沉淀物的RNA + 1E4 cpm的探针，通过调整最终体积至100 μl，0.3M的醋酸钠和盐。加入250 μl 乙醇。
2. 沉淀用70%乙醇和干燥的速度VAC 2分钟洗净。不要过干，杂交，在一个单独的管预混合盐（4 μl 的预混合/ RXN）：预混合：2微升5M氯化钠1.6 μl 0.5M PIPES，pH值7.0 0.2 μl 0.1M EDTA，pH值7.0 0.2μl水。
3. 以下内容添加到您的样品：16 μL甲酰胺4 μl 预混合盐。
4. 涡蓬勃发展。
5. 孵育，100℃，3分钟。
6. 立即转移到58℃，孵育过夜。S1消化缓冲液（最终浓度）：300 mM 的NaCl 的30 mM 醋酸钠，pH5.5 2 mM 的硫酸锌1000单位/ ml 对于1 ml 的消化缓冲液中的S1核酸酶：加入60μl5M NaCl溶液中10 μl 3M醋酸钠，pH 5.5的20 μl 0.1 M 硫酸锌2.5 μl S1核酸酶（400U /μl）907.5 μl 的水。
7. S1消化缓冲液中加入200 μl 的样品。
8. 在37摄氏度下孵育45分钟。
9. 加入1微升糖原（20 mg/ml），500 μl 的EtOH中，在冰上沉淀15分钟。
10. 4摄氏度旋转30分钟。
11. 用70%的乙醇进行清洗。
12. SpeedVac离心，加入5 μl 甲酰胺上载染料（5X TBE，45%甲酰胺，0.25%溴酚蓝）。煮沸3分钟，并放置在冰上。
来源：丁香通
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