摘要：人角膜间干细胞（CSSC）抑制小鼠伤口愈合模型中角膜间质疤痕的形成，并促进天然透明组织的再生。这项研究检查了压缩胶原蛋白凝胶（CGG）作为载体，以提供CSSC角膜治疗。从人类供体的角膜薄壁组织中分离出的CSSCs植入可溶性大鼠腱胶原中，在37°C凝胶化，并通过被动吸收部分脱水至100μm的厚度。 CCG盘的尺寸稳定，易于处理，并牢固地粘附在用纤维蛋白粘合剂加深的小鼠角膜上。 CCSG在培养基中的存活率为80％或更高，并在培养液中维持1周或更长时间；在20％的牛血清中，10％DMSO冷冻保存在液氮中。包含500个CSSC的CCG有效地防止了可见疤痕的形成并抑制了col3a1纤维的mRNA表达。 CSC在预防CSG中疤痕形成方面更有效。胶原蛋白包埋的细胞即使在正常冷冻保存后也可以抑制角膜瘢痕形成。这项研究证明了使用常见的生物材料可以促进干细胞的保存和加工，并且可以提供干细胞的现成递送作为角膜疤痕的治疗方法。

       简介：角膜失明，白内障，青光眼和与年龄有关的黄斑变性是全世界失明的主要原因之一。在发展中国家中尤其如此，据估计，其中有35％至50％的失明是由于角膜瘢痕形成。角膜疤痕的标准治疗方法是角膜移植，该移植用同种异体供体组织代替瘢痕性角膜组织。角质层的免疫特权状态在移植方面取得了巨大成功，使其成为所有器官中最频繁移植的器官。然而，这种治疗依赖于所提供的角膜组织的可用性，在世界许多地方都严格限制了这种角膜组织的可用性。据估计，每70名角膜瘢痕患者中只有1名能够接触供体组织。因此，在世界许多地方，供体组织不可用，角膜盲也未得到治疗。已经提出了几种方法来克服供体的短缺，例如人造角蛋白和各种生物材料来替代疤痕组织，但是到目前为止，还没有长期有效的解决方案。解决该问题的另一种方法是使用干细胞疗法来预防或修复角膜疤痕组织的沉积。我们的研究小组最近证实，人角膜基质干细胞（CSSC）的应用可以防止小鼠间质伤口愈合过程中疤痕组织的沉积，并促进透明基质组织的再生。 .. CSSC是从角膜实质分离的间充质干细胞，与维持角膜上皮稳态的角膜上皮细胞不同。受伤后立即向纤维凝胶中添加CSSC可改善透明度，减少纤维基质成分，并重建基质层组织。随后的研究表明，CSSC分泌的肿瘤坏死因子α刺激基因6蛋白（TSG-6）在防止中性粒细胞侵入受损的角质中起着重要作用。是的可以从临床上进行的微创活检中获得CSSC。这表明它可以为角膜疤痕提供有效的自我治疗。同时，正在进行使用CSSC治疗现有角膜瘢痕的临床试验。胶原蛋白凝胶支架由于其生物相容性，低抗原性和高生物降解性而已成功用于组织工程，但是在组织工程中使用胶原蛋白凝胶的潜在缺点是机械性强度和变形。性别。已经测试了各种方法来改善胶原蛋白凝胶的机械稳定性。胶原蛋白的化学交联可以增加材料的强度，并且交联的胶原蛋白用于植入物中以替代角膜组织。但是，诸如戊二醛的交联剂对植入的细胞具有细胞毒性。增加胶原蛋白凝胶的硬度而不影响其生物相容性，例如棕色。其他人已经开发了通过压缩和被动吸收使凝胶脱水来生产塑料压缩胶原蛋白凝胶（CCG）的技术。这些塑料CCG可以显着提高强度和硬度，并产生植入的细胞而不会引起细胞毒性。包括CSSC在内的角膜基质细胞通常嵌入CCG中，并充当角膜上皮细胞的饲养层。因此，该技术显然与CSSC的可行性兼容。在这项研究中，CCG被视为将CSSC运送到受损角蛋白的一种手段。 CCG改进了CSSC的处理，提高了治疗的有效性，并使CSSC可以可治疗的状态存储。

      CCG制备：压缩胶原蛋白水凝胶根据制造商的规程使用RAFT试剂。简而言之，将酸溶性大鼠尾部胶原蛋白中和，并在含有1 x基础培养基和CSSC细胞的溶液中稀释至1.6 mg/ml的浓度。将胶原蛋白溶液（通常为1 ml）转移到含有12 mm圆形玻璃盖玻片的24孔培养皿的培养孔中。在37℃的二氧化碳培养箱中将胶原蛋白胶凝1小时，然后在分层罩中用纤维吸收剂在室温下脱水15分钟。将胶原蛋白凝胶转移到含有无菌磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）的60 mm培养皿中。准备一个2毫米的学院凝胶，并将无细胞的CCG凝胶存储在无菌PBS中。将含有CCG的细胞在二氧化碳培养箱中于37°C下培养2周。 ..在切片之前，使用Dylight633染色一些无细胞的CCG凝胶。用0.1M LVDS3冲洗凝胶，并在室温下用0.25mg/ml Dylight633NHS酯活性染料对0.1M LVDS3（pH 8.5）染色。用无菌PBS清洁CCG，并保存在4°C直至使用。

      CSSC分离：从宾夕法尼亚州匹兹堡的器官恢复和教育中心获得。已确定的60岁以下捐献者批准用于研究目的的人角膜角膜缘。请在收集后的5天内使用。从胶原酶消化分离的周围组织获得CSSC。将CSSC接种到2％（VOL/VOL）混合的人血清干细胞增殖培养基中。每三天更换一次培养基，一旦80％的细胞融合到培养瓶中，请使用胰蛋白酶快速消化传代的细胞，并在传代过程中冷冻保存。为了冻结凝胶，将充满CSSC的CGG（每2 mm凝胶2000个细胞）转移到含有20％牛胎血清和10％DMSO的DMEM培养基中。将溶液在NMR仪器中缓慢冷却。将冻融的凝胶在80°C的冰箱中放置过夜，转移至液氮中并长时间保存。若要重复使用，请在使用前4-16小时在37°C水浴中快速融化冻融凝胶，并在37°C无血清干细胞生长培养基中平衡凝胶。细胞染色：在胰蛋白酶消化和离心后收集CSSC细胞，将其悬浮在无血清的DMEM/F12中，并在37°C下用每毫升106个细胞染色，用Vybrant DiO染色50 ug/ml。温育20分钟后，将细胞离心，除去上清液，并加入新鲜培养基。将活的和死的CSSC在50μg/ ml Calcin AM培养基中于37°C孵育20分钟，然后在5μg/ ml碘化物中孵育5分钟。

小鼠角膜损伤模型：7-8周大的雌性C57/BL6小鼠在AALAC认可的ABSL2设施饲养，并提供无限的标准饮食。通过腹膜内注射氯胺酮（50 mg/kg）和甲苯噻嗪（5 mg/kg）麻醉六组小鼠。可见疤痕分析需要至少6只眼进行统计显着性分析，而2周为基因表达和纤维化分析提供了合适的时间点。在Debreedman进行局部麻醉之前，向每只眼睛加1滴盐酸普罗卡因（0.5％）。角膜上皮的伤口表面切除是通过使Algerbrush II从小鼠角膜中心经过2 mm来进行的。去除上皮后，再次使用Alger Brush II。这次，施加更大的压力以除去基底膜和10-15μm的前基质组织。手术后立即给予酮洛芬（3 mg/kg）缓解疼痛。两只眼睛受到相同的伤害和治疗。

      Fibringel和CSSC的应用：将CSSC和特定浓度的人纤维蛋白原混合在1：1 PBS，70 mg/ml PBS中，并保存在冰上。角质受伤后，向伤口添加0.5μl凝血酶（100 U/ml），并立即添加1μl纤维蛋白原（有或无CSSC）。纤维蛋白凝胶1-2分钟，然后应用第二轮凝血酶和纤维蛋白原。用庆大霉素滴眼液（0.3％）治疗伤口。角膜上皮在24-36小时内愈合。每天检查一周，然后每周检查一次是否有排斥和感染迹象。

      将CCG放置在角膜上：用PBS冲洗眼睛，并向伤口添加1微升凝血酶，首先在切除的小鼠的眼睛中，然后在活的角膜损伤后的眼睛中。如上，将2mm CCG光盘轻轻放在角质层上，然后再放入1μl纤维蛋白原。此过程使压缩的胶原蛋白牢固粘附在眼睛表面。  CCG角膜单侧成像：使用Olympus FV1000共聚焦显微镜对CCG标记的细胞进行成像，使用Olympus SZX解剖显微镜和落射荧光光学系统对小鼠眼中的凝胶进行成像。将切除的小鼠的眼睛在4℃用3.2％多聚甲醛PBS固定过夜，并进行冷冻切片或石蜡组织学检查。疤痕评估：角膜坏死组织切除术后两周，收集所有眼睛，并用间接照明解剖显微镜对整个球体成像。基于这些图像确定疤痕区域。角膜染色：将受损角质的石蜡切片（8μm）脱蜡2周，并用H＆E染色以观察组织形态。为了证明III型胶原蛋白，通过用含有0.5％wt/vol吐温20的10 mM柠檬酸钠（pH 6）进行微波处理，去除了一些芳基化反应。

     结果：压缩胶原蛋白中的CSSC植入：为了评估CCG作为CSSC传递载体的潜在用途，首先要具有产生含有足够薄的活细胞的凝胶的能力，以至于可以在小鼠角膜中产生在光路上进行了测试。 ..小鼠中央角质层的厚度仅为120微米。因此，我们努力制造最小厚度的凝胶，以限制眨眼反射过程中对眼睛的刺激和去除眼睑的凝胶。结果，取决于添加的胶原蛋白的量，CCG的厚度可以达到至少约100μm，并且每个孔含有约3mg的胶原蛋白。将胶原蛋白含量降低到3 mg以下可以降低压缩凝胶中胶原蛋白的浓度，但不能降低厚度。在凝胶化过程中向胶原溶液中添加CSSC表明，脱水后细胞的活力保持在90％以上，类似于添加到凝胶中的细胞。 CSSC分布在CCG中，总量为20-50μm。  CCG对小鼠角膜的粘附作用：为了测试CGG对角膜的粘附，将角膜上皮在70％乙醇中分离10秒钟，然后用泡沫尖端涂药器刮除。 Dye 633标记的凝胶可以牢固地粘附在暴露于纤维蛋白原和凝血酶的角膜薄壁组织中。 Algerbrush的Debreedman发现CCG可以很好地粘附在角质层上。标记的CSSC嵌入在CCG中，并且在胶合CCG之后可见。有趣的是，CCG附着在身体上两天后，CCG从眼表消失，标记的细胞也消失了。  CSSC移植可防止角膜疤痕形成：伤口切除上皮细胞和角膜基底膜后，将CSSC移植到含有纤维蛋白凝胶的基质中，以防止小鼠角膜纤维化。为了观察植入CCG时CSSC是否保持抑制瘢痕形成的能力，在基质受损后立即在小鼠角质层中使用带有或不带有CSSC的CCG。它可以附着在表面上。接受脱细胞CCG（仅CCG）治疗的大多数眼睛在受伤14天后可见可见的间质疤痕。当CCGS包含CSSC时，很少出现疤痕。从统计学上讲，尽管实验之间的比例各不相同，但CCG中CSSC的存在总是会显着抑制角膜疤痕的形成。角膜疤痕含有细胞外基质和异常的结合组织成分。这种纤维基质被认为是造成光散射的原因，并由于角膜瘢痕形成而导致视力下降。角膜疤痕的两个分子标记是III型胶原蛋白和平滑肌肌动蛋白，它们是小鼠col3a1和acta2基因的产物。如先前所示，这两个基因在受伤后14天的角质中显着上调。当CSSC出现在CCG中，覆盖受伤的眼睛时，激活明显减少。

      用CCG诱导CSSC诱导的基质形态修复：损伤后14天通过H＆E染色分析组织切片，以评估使用或不使用CSSCCCG治疗的角膜实质的再生。结果表明，CCG治疗仅导致伤口愈合区域的组织水肿，细胞增殖和异质上皮覆盖。加载了CSSC的CCG暴露的角蛋白显示出与正常角蛋白无法区分的组织学，并显示了在通过阿尔及刷伤口切除术切除的区域中天然角化组织的再生。角膜水肿区域在没有CSSC细胞的情况下得到了愈合，并含有胶原蛋白III，这是众所周知的角膜瘢痕形成的迹象，但是用含有CCG的干细胞处理的组织并未染色胶原蛋白III。 CCG中CSS 的CSSC剂量响应：在先前的研究中，在纤维蛋白凝胶中使用了50,000个CSC细胞来抑制角膜伤口中的疤痕形成。该浓度代表在愈合过程中残留在小鼠角质层表面的纤维蛋白凝胶中的最大细胞数。为了评估抑制角膜疤痕的CSSC的有效量，将CSSC细胞以各种浓度（50-2500个细胞）植入CCG中。角膜疤痕分析显示50个细胞对疤痕没有抑制作用，而125、500和2500个细胞对疤痕具有明显的抑制作用。将CCG中的500个CSSC与相同数量的纤维蛋白原细胞进行比较，证实了植入CCG中的每个CSSC细胞的有效性都得到了显着提高。

      用CCG冷冻保存CSSC：要评估CSSC冷冻保存的有效性，请使用常用的细胞培养方法用液氮冷冻含有CCG的细胞。储存2周后，将凝胶冷冻并解冻，在无血清培养基中培养过夜，并用钙黄绿素AM活性染料标记。在显微镜下，这些细胞存活并凝结成50-100μm的聚集体。冷冻/融化CCG在小鼠伤口愈合模型中的使用表明，保存的细胞在控制角膜疤痕方面非常有效。

       结论：在CCG中植入CSSC是一种快速简便的方法，可以防止透明角膜组织上形成疤痕并诱导其再生。这种新方法具有为大量角膜瘢痕患者提供治疗潜力的潜力。