Joy Aho1, Michael O’Connor2, Elizabeth Hughes3, Thom Saunders3, Electra Coucouvanis1, and Jessie Ni1

摘要

在转基因和敲除研究中，维持多能性对利用小鼠胚胎干(ES)细胞至关重要。已经发现许多因子可以影响ES细胞的多能性,其中之一就表现在白血病抑制因子（LIF）对ES细胞培养的影响。关于抑瘤素M（OSM）能补偿LIF在ES细胞培养中的作用，对此存在不一致的报道。一些研究提示在维持ES细胞多能性方面，OSM不如LIF有效。然而，其他研究发现它们是等效的。在本研究中，我们证明在维持ES细胞多能性上，人OSM拥有与小鼠LIF相类似的功效，包括长期（超过10天）维持多能性、体外分化的能力、活化STAT3的能力和种系传递能力。我们的研究提示OSM可能是在早期胚胎发育中发挥作用的另一种因子，并且在小鼠ES细胞培养时，OSM可以被用作LIF的替代物。

材料和方法

细胞培养：CJ7 ES细胞系由Tom Gridley赠予。高葡萄糖DMEM培养基另加15%胎牛血清（FBS），4 mM谷氨酰胺，10 μM 2-巯基乙醇，1%MEM非必需氨基酸，每毫升50 IU青霉素，每毫升50 μg链霉素，和每毫升103U的LIF （ESGRO；Chemicon，Temecula CA）或者10 ng/mL的抑瘤素M（R&D Systems，目录#295-OM），以此培养ES细胞。细胞生长于辐射照过的小鼠胚胎滋养细胞（MEFs）上或者0.1%明胶包被的平板上。细胞每两天传代一次。
 

把106个细胞传到含有10%FBS，每毫升50 IU青霉素，每毫升50 μg链霉素，4 mM谷氨酰胺和DMEM培养基的6孔组织培养皿中，以此制备类胚体（EBs）。用培养基冲洗培养皿，分离细胞团。把细胞团转移至有盖培养皿，然后每天更换培养基。要进行分化时，悬浮培养EBs 4至6天，然后转移0.1%明胶包被的24孔板，让细胞贴板生长7天，再进行免疫细胞化学实验或为RT-PCR提取RNA。
 

RT-PCR：用RNAeasy试剂盒（Qiagen），根据产品说明书从未分化的ES细胞和分化的EBs中提取RNA。使用Superscript First-Strand SynthesisSystem（Invitrogen），根据产品说明书，500 ng RNA通过随机六聚体引物进行逆转录。2 μL cDNA用作扩增模板。所有引物在55℃下退火，扩增35个循环。

免疫细胞化学：所用一抗（rtxh/mOct3/4；mxh/mSox2；gtxmNanog；mxβIIITubulin；mxhTroponinT和gtxhHNF3β）购于R&D Systems。细胞或EBs转养到24孔板中的盖玻片上。在室温下用4%多聚甲醛固定细胞20分钟，然后将细胞在含有1%BSA（PBA）的PBS中洗4次。用含有PBA溶解的0.1%Triton® X-100的10%驴血清封闭细胞45分钟。然后加入10 μg/mL的一抗，孵育3个小时，之后把细胞在PBA中清洗三次，每次洗5分钟。然后，用5 μg/mL的NothernLightsTM557连接的二抗（R&D Systems）孵育细胞1个小时，然后如上清洗细胞。

STAT3活化水平：用Active STAT3 DuoSet IC®试剂盒（R&D Systems）检测STAT3的活化水平。根据试剂盒说明书，用生长于或未生长于MEFs上的未分化ES细胞制备细胞核提取物。用Bradford检测对蛋白质进行定量分析。STAT3活化水平根据产品说明书而确定，然后根据总蛋白水平进行标准化处理。

小鼠嵌合体的生产：所有程序由密西根大学动物使用和照顾委员会批准。根据国家研究委员会关于实验动物照顾和使用指南概述的原则和程序对动物提供照顾。在含有LIF或者OSM的培养基中连续传代5次后，用胰蛋白酶处理细胞，然后将16个ES细胞显微注射到囊胚中。囊胚取自与C57BL/6J X DBA/2J/F1雄小鼠（The Jackson Laboratory，BarHarbor，ME）交配的超数排卵的C57BL/6NCrl雌小鼠（Charles RiverLaboratories，Wilmington，MA）。注射当天，用标准方法把显微注射的囊胚转移到假孕的受体雌鼠体内。用嵌合体与C57BI/6J雌鼠交配来检测种系传递。

总结

我们试图确定抑瘤素M（OSM）（一种与LIF密切相关的细胞因子）是否可以模拟LIF维持胚胎干细胞（ES）多能性。通过判断嵌合体形成和种系嵌合传递，表达多能性标识物，以及体外分化的能力，我们证明了10 ng/mlOSM培养的与LIF培养的ES细胞拥有相类似的多能性。

OSM培养细胞的STAT3（LIF的下游分子）活化水平与LIF培养细胞的STAT3活化水平存在略微差异（图4）。因为那些细胞仍能维持多能性，所以我们猜测该差异不会明显影响STAT3下游的信号水平。OSM培养，但无MEFs滋养的细胞的Nanog RNA和蛋白质水平没有明显变化（图2），这进一步支持了我们的猜测。虽然之前认为Nanog在独立于STAT3的通路中，但是最近的证据表明Nanog是STAT3和LIF信号的直接目标分子（Suzuki, et al. 2006）。另外，我们发现当不用OSM和LIF培养细胞时，这些细胞的STAT3活化水平在三代之内就急剧降低，并且缺失多能细胞的形态。

除了我们研究表明LIF和OSM都是对早期胚胎发育重要的因子外，在植入期OSM和LIF均表达于子宫，这也预示LIF和OSM都是影响早期胚胎发育的重要因子（Fouladi-Nashta, et al. 2005）。缺失LIF或者OSM的敲除小鼠可以出生并存活至成年（Morikawa, et al. 2004; Fouladi-Nashta, et al. 2005）。这可能因为在胚胎发育早期这两种细胞因子可以互相补偿。

关于R&D Systems

R&DSystems总公司于1976年成立于美国，在美国NASDAQ上市(TECH)。公司一直致力于各种细胞因子及其相关分子的生产研发。R&D Systems产品覆盖面广，种类丰富，质量稳定可靠，其生产的各种ELISA试剂盒、重组因子及抗体以其卓越的品质赢得了世界各国科研及临床诊断机构的青睐。

此文转载来源：丁香通