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质粒的制备、提取十二

四、 培养基配方 1. LB 液体培养基 100ml 配方如下: 胰蛋白胨 1g 酵母提取物 0.5g NaCl 1g DDW 定容 100ml 2. LB 固体培养基 100ml 配方如下: 胰蛋白胨 1g 酵母提取物 0.5g NaCl 1g 琼脂粉 1.5g DDW 定容

质粒的制备、提取十一

三、 质粒提取 (三) 质粒的纯化 附录: 1 OD260 和 OD280 的比值表示质粒的纯度。比值大于 1.8 ,说明纯化产物的纯度达到了 90% 。纯化好的质粒可用于转染实验,一般纯化步骤在细胞间

质粒的制备、提取十

三、 质粒提取 (三) 质粒的纯化 1. 将之前提取好的质粒放入 1.5ml 离心管中,加入 1/10 体积的 3mol/L 无菌乙酸钠溶液。 2. 加入 2 倍体积的无水乙醇,放置于 -20 ℃沉淀 4-6h 或过夜。 3

质粒的制备、提取九

三、 质粒提取 8、 将吸附柱放入收集管内,离心得到的上清转移至吸附柱,室温, 15000rpm ,高速离心 30s 。 9、 弃废液,将吸附柱放入收集管,加入 700ul WB 溶液到吸附柱中, 15000rpm ,

质粒的制备、提取八

三、 质粒提取 (二) 收获细菌并裂解 1. 离心扩增好的菌液,按说明书将菌液重悬,转入 1.5ml 离心管中。 2. 用质粒小量抽提试剂盒,按说明书要求提取质粒。 3. 细菌高速离心 1min, 彻

质粒的制备、提取七

三、 质粒提取 (一) 摇菌培养 1. 将鉴定测序正确的克隆菌液涂在 LB 固体平板。 2. 置于 37 ℃恒温培养箱,培养 12-17h ,待长出菌落。 3. 灭菌 15ml 离心管内加入 5ml 含抗生素的 LB 液体培

质粒的制备、提取六

二、 菌落制备主要环节 (四) 转化 1、 将感受态细胞 DH5ɑ 从 -80 ℃冰箱中取出,立即置于冰中,使其在冰中融化。 2、 连接产物加入 DH5ɑ感受态细胞溶液中,轻轻吹打使连接产物分布

质粒的制备、提取五

二、 菌落制备主要环节 (三) 连接 将回收的 PCR 产物连接入 pGL3-Basic 载体中,反应体系如下: T4 连接酶 1uL 5×buffer 1uL 酶切质粒( 50ng ) _ul 酶切 DNA 片段( 100ng ) _uL DDW 20uL * 16℃连接

质粒的制备、提取四

二、 菌落制备主要环节 (二) 双酶切 将 PCR 回收产物和 pGL3-Basic 空载体同时进行双酶切。 1. 双酶切体系 (1) DNA 回收片段酶切的试剂和剂量如下: Xho Ⅰ 1ul Hind Ⅲ 1uL DNA 片段( 300

质粒的制备、提取三

一、 操作前准备 1. 仪器设备 PCR 仪、 37℃ 恒温培养箱、 37℃ 恒温摇床、水浴锅、超净工作台、高速离心机等等。 2. 试剂 过表达载体质粒( pGL3-Basic 等)、限制性内切酶、胶回收试剂

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