人弥漫性大B细胞淋巴瘤小鼠肿瘤模型的建立实验
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2017-03-06
人弥漫性大B细胞淋巴瘤小鼠肿瘤模型的建立：（1）深入研究淋巴瘤发病机理；（2）评价治疗药物；（3）建立人弥漫性大B细胞淋巴瘤小鼠模型的条件及肿瘤特点。
实验方法原理
采用SCID 小鼠皮下接种107 细胞可成功地建立人人弥漫性大B 细胞淋巴瘤（DLBCL ）移植瘤模型，成瘤率70%，肿瘤的组织学表现类似于人DLBCL。
实验材料
试剂、试剂盒
RPMI 1640培养液 青霉素 谷氨酰胺 链霉素 CD19 APC抗体 CD20 PE抗体 CD24 PE抗体 山羊抗兔IgG FITC
仪器、耗材
流式细胞仪 离心机 水浴 培养瓶 冰箱 注射器 离心管 封口膜 微量移液器
实验步骤
一、细胞培养
1. SUDHL-4为人GCB 样DLBCL细胞株。将初始密度为2.5× 105 /ml 细胞置于含10% FBS、100 U /ml 青霉素、100 μg /ml 链霉素、30 μg /ml 谷氨酰胺的RPMI1640 培养液的T25 细胞培养瓶中，在37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱中培养。
2. 待2-3 d 第1 次传代后，转入T75 细胞培养瓶，以后根据细胞生长情况适时移入T150 细胞培养瓶。
2. 待2-3 d 第1 次传代后，转入T75 细胞培养瓶，以后根据细胞生长情况适时移入T150 细胞培养瓶。
二、流式细胞术检测样品的制备
1. 取对数生长期的SUDHL-4 细胞，用无血清PBS 漂洗2 遍后，于PBS /2% FBS 中制成细胞悬液( 1 ×107 /ml) 。
2. 根据说明书建议的适宜浓度加入相应抗体，4℃避光孵育15 min；若需胞内染色，则先采用1% 多聚甲醛对细胞进行固定，然后用破膜剂( 0.25% Saponin) 处理，同时加抗体进行染色，4℃避光孵育过夜。
3. 细胞用PBS /2% FBS 漂洗1遍，悬于200 μl PBS 待测。
4. 流式细胞仪检测时每份样品均测定3 × 105 细胞，用FlowJo 软件对检测结果进行分析。
2. 根据说明书建议的适宜浓度加入相应抗体，4℃避光孵育15 min；若需胞内染色，则先采用1% 多聚甲醛对细胞进行固定，然后用破膜剂( 0.25% Saponin) 处理，同时加抗体进行染色，4℃避光孵育过夜。
3. 细胞用PBS /2% FBS 漂洗1遍，悬于200 μl PBS 待测。
4. 流式细胞仪检测时每份样品均测定3 × 105 细胞，用FlowJo 软件对检测结果进行分析。
三、实验动物
1. SPF 级SCID 小鼠，雌性，5 周龄，体重16-20 g随机分组，饲养及实验均在恒温( 20 - 26℃) 、恒湿( 50% -56%) 的SPF 级鼠房内进行。
2. 小鼠置于层流架带盖鼠盒中，空气经中效过滤，喂食标准颗粒饲料，与鼠接触的一切物品均事先经灭菌处理。
2. 小鼠置于层流架带盖鼠盒中，空气经中效过滤，喂食标准颗粒饲料，与鼠接触的一切物品均事先经灭菌处理。
四、细胞接种
1. 取对数生长期的SUDHL-4 细胞，用无血清PBS 漂洗2 遍后，悬浮于无血清PBS。
2. 实验组小鼠( 每组10 只) 在其一侧肋部皮下接种0.1 ml 含107 细胞的细胞悬液； 2 个成瘤对照组分别为每组3 只，在右侧肋部皮下接种0.1 ml 分别含5 × 106细胞和1 × 106细胞的细胞悬液； 正常对照组( 每组10 只) 在右侧肋部皮下注射0.1 ml PBS。
3. 接种前小鼠不经任何处理。
2. 实验组小鼠( 每组10 只) 在其一侧肋部皮下接种0.1 ml 含107 细胞的细胞悬液； 2 个成瘤对照组分别为每组3 只，在右侧肋部皮下接种0.1 ml 分别含5 × 106细胞和1 × 106细胞的细胞悬液； 正常对照组( 每组10 只) 在右侧肋部皮下注射0.1 ml PBS。
3. 接种前小鼠不经任何处理。
五、荷瘤鼠指标检测
1. 实验期间每日观察小鼠一般情况、成瘤及肿瘤生长情况。
2. 每日测量体重和肿瘤长短径和高度，并计算肿瘤体积( 计算方法： π/6 × 长× 宽× 高) ；当瘤体达到1 200 mm3 时视为人道终点。
3. 小鼠经麻醉并拉颈处死后，先观察体表各部位成瘤情况；然后解剖动物，观察各内脏器官和淋巴结转移情况。
4. 取下肿瘤，置于10%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡切片，HE 染色观察。
2. 每日测量体重和肿瘤长短径和高度，并计算肿瘤体积( 计算方法： π/6 × 长× 宽× 高) ；当瘤体达到1 200 mm3 时视为人道终点。
3. 小鼠经麻醉并拉颈处死后，先观察体表各部位成瘤情况；然后解剖动物，观察各内脏器官和淋巴结转移情况。
4. 取下肿瘤，置于10%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡切片，HE 染色观察。
六、统计学处理
实验数据以均数± 标准差( X ± SD) 表示，采用SPSS11.5 统计软件包处理，各组样本均数比较采用单因素方差分析( ANOVA) 。
一、实验讨论
虽然WHO 将DLBCL 列为一类独立的病种，但其在流行病学、临床特征、组织形态学、分子遗传学和免疫表型、对治疗的反应及预后等多方面，均表现出明显的异质性。DLBCL 的免疫表型十分复杂，且与预后的关系非常密切。研究与肿瘤细胞发生、发展相关的蛋白表达，不仅在DLBCL 的诊断分型、预后评估以及临床治疗中均具有重要的指导意义，而且有助于淋巴瘤发病机理的阐明，及特异性靶向治疗药物的研发。尽管此前曾有少量文献报道针对人类来源的DLBCL 细胞株SUDHL-4 的研究，本实验对SUDHL-4 细胞体外培养的生物学特性和相关标记物表达进行了研究，并建立了稳定的基于SUDHL-4 细胞的人DLBCL 动物模型。
虽然WHO 将DLBCL 列为一类独立的病种，但其在流行病学、临床特征、组织形态学、分子遗传学和免疫表型、对治疗的反应及预后等多方面，均表现出明显的异质性。DLBCL 的免疫表型十分复杂，且与预后的关系非常密切。研究与肿瘤细胞发生、发展相关的蛋白表达，不仅在DLBCL 的诊断分型、预后评估以及临床治疗中均具有重要的指导意义，而且有助于淋巴瘤发病机理的阐明，及特异性靶向治疗药物的研发。尽管此前曾有少量文献报道针对人类来源的DLBCL 细胞株SUDHL-4 的研究，本实验对SUDHL-4 细胞体外培养的生物学特性和相关标记物表达进行了研究，并建立了稳定的基于SUDHL-4 细胞的人DLBCL 动物模型。
在不同条件下对SUDHL-4 细胞进行培养后发现，10%为相对适合的血清浓度。此前有文献报道，人DLBCL 细胞株体外培养建议采用Iscove' sMEM。本实验证明，采用加入10% FBS 的RPMI1640 培养，细胞生长良好，传代速度适中，4－ 5 代的细胞活力旺盛，具有较高的接种成功率，且适于进行流式分析等其他实验。
此文转载来源：丁香通
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