Dr.S.Gardell(MSDRL，WestPoint，PA)纯化了从南美蝙蝠唾液腺中分离的一种外 分泌蛋白，因此其部分肽序列(GlyLeuGlyCysAspLeuMet)是开始本实验的关键。为检 验不用传统筛选方法即能克隆该蛋白基因的假说，我们采取了如下策略:
a).在Lambdagt22中建立一个在蝙蝠唾液腺中所有转录子的cDNA库，并在边侧加 上SP6、T6聚合酶启动子，这样可以直接用两种启动子序列之一作引物进行扩增和测 序。
b).合成四组引物，组合起来代表已知的部分蛋白序列的全部有效密码子组合 (1024种衍生列)。C).这些引物与适当的T7或SP6聚合酶序列引物组合成对，以总cDNA 库作模板，进行PCR扩增。所得到PCR产物应该代表编码该蛋白的部分cDNA。对这些 PCR产物直接测序应能得到足的序列信息以合成同源引物，进一步进行PCR扩增，产生 的DNA片段结合起来可给出编码该蛋白的cDNA的完整序列。
直接用2% 琼脂 糖凝胶分析PCR产物，组混合引物[引物1:5"(CT)TXGG(ACGT)TG(CT) GA (CT)(CT)TXATG3"，。每组混合引物产生约450bp和550bp的两个产物。用Wong等所 述的方法进行凝胶纯化和测序该PCR的主要产物450bp带。混合引物产生清蜥可读的序 列(约200个核苷酸)，虽然可有256种引物组人合(简并度)。在这个序列信息的基础 上，合成另两组引物[引物Ⅱ(正向)]分别与SP6或T7聚合酶序列引物配对，按前面所 述进行PCR扩增，引物Ⅱ/SP6和引物Ⅲ/T7分别产生270bp和420bp片段，测定这两个片 段序列，与最初得到的DNA片段结合来，得到一个467bp编码序列。该cDNA(270BP+420 bp)的多余序列为200bp的PolyA尾序。
PCR策略
(A)n、(C)n、(G)n、(T)N:同聚物序列SP6，T7:SP6和T7聚合酶启动子，分别构建 入Lambdagt载体。B. 琼脂 糖凝胶分析PCR产物。PCR在总体积100μl，含50mMKCL、 10mMTris，pH8.3，1.5mMMgCl2，0.01%明胶，200μM每种dNTP，2.5uTup聚合酶， 150ng噬菌体库模板DNA，50ng(0.1nmoles)每种引物的体系中进行。程序如下:初始模 板变性94℃，8分钟;之后为94℃2分种，60℃3分种，30个循环。PCR反应产物用氯仿 抽提以除运送放物油，从100μl中取5μl样品加到2%琼脂糖凝胶上。溴化乙啶染色。
GGATGACCACCCACAGCAGCTGCCTAACCATGAAGCTGGTGACCATCCTCATGCTGACC
GCCCTCCCCCTGTACTGETATGCGGGGCTTGGELGEGATCTTATGGACAATGTGGTCAAR
TTGACCATCGATTCTAATGTGGACGTGAATACATACATCGATAACCTGAAAGAGTTCCTA
CCAGGTGAAGAAACTCAAGAGGCCTTCAAATTCATGAAGGAATGCTTTETCGATCAGAGC
GAAGAAACTCTGGAGAAGATCAAAGTTCTGCAGCAATCGATATACAGTAGCGTTTGGTGT
GCTCGGGACACTAACTTCACATGACCACAGAGATTGTCCACAGACCAACTGTCCATTGG
TAGAAGCCECAGCTGAGCTTTCCTTCTTCATCCTTCGATCTACAAATGCAAGACAATTGT
AAACCTGACATACGTTTGEATTTCAATAAAGCATCCTGCAAAACCAAAAA
核苷酸序列及预测的 氨基酸 序列。从制备性琼脂糖凝胶中分离PCR产物，并按厂 商说明书(Bio101)用Geneclean纯化。按厂商说明书(美国Biochemical序列酶)，用 32P5"末端标记引物和修饰过的T7聚合酶(测序酶)测序。每个反应含100ng(0.4pmoles )模板DNA和20ng(4pmoles)5"32P末端标记的引物，每反应为2卓106cpm。划线部分为 起始本实验的多序列。计算机分析表明该cDNA含有一个可读框，编码110个 氨基酸 ， 起始的18个氨基酸推测为信号肽，还发现用于起始这种蝙蝠唾液蛋白实验的七个氨基 酸在蛋白的N-末端(图2，划线部分)。检索NBRF数据库揭示该蛋白与鼠前列腺类固醇 结合蛋白C3链前体有39%的同源性，最重要的同源性是成熟蛋白中所有三个半胱氨酸 残基的位置。
我们已经证明聚合酶链反应可以用于从复杂分子库如cDNA库扩增特异的DNA序 列。在本实验中专门设计的Lambd gt22载体，通过用含有适当内切酶位点和聚合酶启 动子序列的5"端、3"端引物接头定向克隆cDNA分子。从克隆的PCR产物制备序列特异 的探针，用传统方法筛选基因库，我们估计分离cDNA的丰度为每10，000个噬菌体重 组子中有1个克隆。用一组代表简并度为256的寡聚 核苷酸 引物能进行特异扩增的事实 进一步表明了该方法的灵敏度，而且如图1B所示，所有四个引物混合物产生相同PCR 产物，表明具有更大简并度的寡聚 核苷酸 引物库也能进行特异扩增，PCR可以容忍1个 碱基对的错配。
PCR方法、混合引物和PCR产物直接测序结合起来，可极大地减少建立cDNA库的时 间，扩大该方法的用途。
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