试剂、试剂盒

      酚   氯仿   异戊醇   乙醚   KAc   乙醇   DEPC 处理水   TBE 缓冲液   上样液   KCI。

仪器、耗材

      透析袋

实验步骤

一 材料与设备

      1) 酚：氯仿：异戊醇 (25:24:1),

      2) 乙醚

      3)2.5mol/LKAc

      4) 乙醇

      5)DEPC 处理水

      6)TBE 缓冲液

      7〕上样液：40% 甘油，0.4% 啡叮溴红的 TBE 溶液

      8) 透析袋

      9)KCI

二 操作方法

1. 酚：氯仿：异戊酵提取法

      1) 蔗糖密度梯度离心纯化的病毒与等体积饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1) 混合，冰浴中振荡 3〜5 min。

      2) 在 4℃ 下，8000 g 离心 lOmin，吸出上层水相，再用同样方法处理第二次，获得的上层水相用乙醚洗涤；二次去酚，水相加 1/10◦体积的 2.5mol/LKAc 及 2 倍体积乙醇，在—20℃ 下保存

2. 琼脂糖凝胶制备电泳纯化法

      1) 制备 1.2% 琼脂糖-TBE 凝胶。

      2) 在离心去乙醇的 RNA 小管中，加入 40〜80ul 电泳上样液，上样进行电泳。电泳液为 TBE，电 60〜100V, 电泳 3〜6 h

      3) 切下含病毒 RMA 区带的凝胶条，装入透析袋，内加 0.5〜2 mlTBE, 袋的两端用线或普通木夹或塑料夹）封口，放在电泳槽中再次进行电泳。约 lh 后 RMA 走出凝胶，吸出袋内 RNA, 加 KC1 至 0.25mol/L，加 2 倍体积乙醇，在一下保存。

3. 乙型脑炎病毒 RNA 纯度检查

      1) 乙型脑炎病毒 RNA 感染性的鉴定可用小白鼠脑内滴定来完成，也可以在麦胚无细胞蛋白合成系统中测定其 mRNA 活性。

      2) 测定分子质量大小，乙型脑炎病毒 RNA 在琼脂糖凝胶电泳中为单一区带。RNA 大小标记物可用正常动物细胞的 18SRNA 和 28SRNA, 在小白鼠细胞中，这两种 rRNA 的分子质量分别是 0.7X10⁶Da 和 1.65Xl0⁶Da

注意事项

      1) 为了获得高滴度病毒，要选择对乙型脑炎病毒敏感的培养细胞。对子 c6/36 培养细胞，病毒繁殖滴度髙，并 R 病毒能对该细胞造成持续感染，细胞病变轻微。病毒感染后，培养 2〜4 天，收获病毒，又可以换上新鲜培养液继续培养，这样就能从一批培养细胞中不断获得含病毒的上清液。

      2) 提纯的病毒 RNA 在 -20℃ 乙醇中比较稳定，至少可保存 2 个月。

此文转载：丁香通