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TRIzol RNA提取方法
实验方法原理
1. Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,采用变性剂即内含异硫氰酸胍酚和β-巯基乙醇等变性物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。

2. 异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质,并使蛋白质二级结构消失,细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。

3.  细胞裂解后,细胞释放出蛋白质、DNA、RNA等物质,再根据它们在不同的PH值和不同极性溶剂的溶解度不同而使得分开。

实验材料  细胞样品
试剂、试剂盒 TRIzol试剂氯仿异丙醇75%乙醇DEPC H2O
仪器、耗材 离心管离心机 EP管 匀浆器 移液管 冰袋 漩涡振荡器
实验步骤
1. 样品处理:

(1) 培养细胞: 收获细胞1-5×107,移入1.5ml离心管中,加入1ml Trizol,混匀,室温静置5min。

(2) 组织:取50-100mg组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置1.5ml离心管中,加入1ml Trizol充分匀浆,室温静置5min。

2. 加入0.2ml氯仿,振荡15s,静置2min。

3. 4℃离心,12000g×15min,取上清。

4. 加入0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min。

5. 4℃离心,12000g×10min,弃上清。

6. 加入1ml 75%乙醇,轻轻洗涤沉淀。4℃,7500g×5min,弃上清。

7. 晾干,加入适量的DEPC H2O溶解(65℃促溶10-15min)
收起 
注意事项
1.样品量和Trizol的加入量一定要按步骤(1)的比例,不能随意增加样品量或减少Trizol量,否则会使内源性RNase的抑制不完全,导致RNA降解。

2.实验过程必须严格防止RNsae的污染。
其他
一、RNA的定量计算

1.  RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此,可以用260nm波长分光测定RNA浓度,OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径,用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:

RNA(mg/ml)=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000
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