酵母质粒抽提方法
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2017-03-06
问：想从酵母提取质粒，转化大肠杆菌，按分子克隆的方法，可能都线性化了，转化率为0，请问有什么好的办法？
答： 以下是我的方法，曾提过数百个，好像转化效率还可以,基本上都提出来了。
个人体会是Lyticase的活性要好，而且涡流混匀这一步好像要尽量充分吧，u see，酵母质粒所以不好提，就是因为酵母细胞有很厚的细胞壁，再加上酵母质粒拷贝数目多少的问题，所以破壁一定要充分。其次吗？感受态细胞的状态也会有很大的影响……再有，如果担心酵母细胞的活性问题，也可以活化一下再提，不过好象我的实验中这项不是问题。
详细步骤：
1、挑10mm2的酵母溶于含50μl的TE ( pH7.0) 的1.5ml离心管中。
2、每管加10μl的裂解液（Lyticase 5 unit/μl, sigma避光保存），涡流混匀。
3、37℃，200-250r/m，30-60min。
4、每管加10 μl 20％SDS，涡流1min。
5、–20℃冻存过夜。
6、室温下融解后，涡流混匀。
7、质粒提取。
7.1 1.5ml离心管加TE Buf至200μl的（pH7.0）
7.2 200μl酚,涡流5min后，4℃，14000r/m离心10min。
7.3 取上清至干净的1.5ml Eppendorf管中。
7.4 等体积酚氯仿，涡流5min。
7.5 4℃，14000r/m离心10min。
7.6 取上清至一干净的1.5ml Eppendorf管后加等体积氯仿，涡流混匀。
7.7 4℃，14000r/m离心10min。
7.8 取上清至一干净的1.5ml Eppendorf管中。
7.9 8μl 10M NH4Ac和500μl 95％～100％的乙醇。
7.10 –70℃，1h。
7.11 4℃，14000r/m离心10min。
7.12 弃上清，空气中干燥。
7.13 10μl H2O悬浮细胞。
8、转化（要求：4℃预冷）
8.1 冰上融化感受态细胞（感受态细胞的制备见分子克隆啦）Top10f’。
8.2 加100μl转化细胞到预冷的1.5ml离心管中，枪头轻轻吹打混匀。
8.3 冰上孵育30min。
8.4 42℃，45S～50S。
8.5 冰上孵育2min后，加1ml LB。
8.6 37℃，1h，250r/m.
8.7 2500r/m，5min，RT。
8.8 弃上清，在剩余的溶液中悬细胞。
8.9 接种LB/Amp板，37℃，倒置培养24h。
8.10 挑克隆，过夜培养，常规碱裂解法提质粒 。
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