何时该选择高保真聚合酶？
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2017-03-06
在PCR实验中使用适当的聚合酶将确保最佳的产量和特异性，但市场上有那么多种聚合酶，如何选择，有时还真是个难题。厂家一般都会提供一个选择指南，列出每个产品的特异性、保真度、产量等。保真度是实验成功最关键的因素之一，不可不重视。
什么是聚合酶保真度？
DNA聚合酶的保真度是指准确复制目的模板的结果。具体来说，这涉及到多个步骤，包括读取模板链，选择正确的三磷酸核苷，并将此核苷酸插入3’引物末端的能力。为了高效区分正确和错误的核苷酸，一些DNA聚合酶具有3’到5’核酸外切酶活性。这种“校正”活性可切除不正确掺入的单核苷酸，并将其替换成正确的核苷酸。高保真PCR使用掺入错误率低且具有校正活性的DNA聚合酶，以保证目的DNA的忠实复制。
保真度在何时很重要？
在设计PCR实验时，你首先要考虑你的应用是否需要高保真聚合酶。如果实验结果依赖于正确的DNA序列（如克隆或测序），那么你就要尽量减少错配核苷酸的掺入。而对于普通PCR或菌落PCR，确定扩增子是否存在或质粒上是否带有插入片段，那高保真则大可不必。由于某些高保真聚合酶的强劲特性，一些研究人员在所有扩增中都使用它们。生物通 www.ebiotrade.com
如何测定保真度？
厂家通过各种不同的方法来确定DNA聚合酶的保真度。Thomas Kunkel曾介绍过一种方法，使用M13噬菌体的部分lacZα基因，通过宿主菌落颜色的变化来检查DNA合成中的错误。以Kunkel的分析为基础，Wayne Barnes则开发出一种分析，利用PCR来复制整个lacZ基因和两个抗药性基因的一部分，随后连接、克隆、转化和蓝白斑筛选。若lacZ基因存在错误，则破坏β-半乳糖苷酶活性，导致白斑的出现。通过这些实验方法，白斑克隆的比例可转化为错误掺入的数量。Sanger测序则提供了保真度的更直接读取，可检测所有突变。利用这种方法可确定聚合酶的整个突变谱。
何为高保真？
通过以上介绍，相信你对保真度这个概念有了一定的了解。下次在购买高保真酶之前，除了看看宣传单页上的介绍，还可以了解一下他们是如何测定的，这样就不会被各种数字所蒙蔽了。
此文转载来源：新浪博客
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