一提到克隆，大家脑海中首先浮现的肯定是酶切、连接。其实，克隆的方法还有很多，比如NEB的一步法克隆。NEB近日推出了NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix，最快能在15分钟内完成多个片段的组装，而无论DNA片段长度如何及末端是否匹配。

      这种预混液由不同酶混合而成，协同作用于同一缓冲液中，使克隆多片段 DNA 变得更加简单方便。其中，核酸外切酶产生单链3’突出端，促进互补片段的退火；聚合酶填补每个退火片段中的缺口；而DNA连接酶则连接切刻。这种方法既能连接单链寡聚核苷酸，也能克隆携带有不同长度重叠区域（15-80 bp）的双链DNA片段。短至100 bp、长至19 kb的DNA片段都能组装。

      与NEB之前推出的Gibson Assembly Master Mix相比，新产品在性能上更优越。这表现在：克隆后保真度高、正确率高，而无需反复筛选、测序；DNA 片段连接效率高，无论起始量更低还是片段更长；可连续克隆，无需考虑片段末端内切酶位点是否匹配。这种方法可用于快速构建DNA片段，用合成的单链DNA寡聚核苷酸桥式连接两个双链DNA片段，如接头插入。此外，商业机构在使用NEBuilder HiFi时无需缴纳授权费。

      这一体系既可以实现快速无误的标准克隆，也可以用于多个片段的DNA组装。操作流程更简便，而克隆后的DNA无需纯化就可直接用于转化和作为 PCR、RCA 模板。有了NEBuilder HiFi，您可以轻松地同时进行多种DNA操作，包括定点突变。

      此外，NEB还提供了一种免费工具，名为NEBuilder® Assembly Tool（nebuilder.neb.com），以简化引物的设计。由于片段的兼容性，使用其他无缝克隆方法的研究人员也能轻松使用NEBuilder HiFi 来组装。

此文转载来源：生物通