转染——让克隆的核酸进入真核细胞中，已经成为研究和控制真核细胞基因表达的重要手段。比如表达纯化特定的蛋白；鉴定一个基因的生物学特性；突变分析；研究基因表达对细胞生长的影响，研究基因表达的调控机制等等，等等。如今广义的转染不单包括了DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。生物通在前面已经为大家集中介绍了8个不同的品牌的转染试剂——不是选美，没有包医百病的万灵丹，只是希望有助于你了解每种产品的特性。这里我们最后“唐僧”一下，转染中一些值得注意的事项。
很多因素会影响转染效率，细胞株本身啦，细胞培养环境啦，转染的DNA、RNA或者蛋白的质量和特性啦，转染方法啦，等等。每个转染高手也必然有自己的独门心经，只可惜大家都为实验或者生活而疲于奔命，没有几个人愿意静下心情来仔细总结经验汇集成文字——那些曾经用无数失败的痛苦烦恼换回来的宝贵经验，那些曾经以为会永远铭刻于脑海的教训，随时间的流逝而终于渐渐褪色，到模糊。即使偶尔有珠玉掩埋于浩瀚的口水中，也难以汇串成珠。试剂盒的盛行，让实验更快，更简单，也更机械化，相信更多人更愿意先抓起Protocol 123地往下做，直到碰壁再苦思原因。其实等碰得遍体鳞伤回头一看就会醒悟，很多坑，只要事前注意了就不会陷进去的。幸好还有一些资料可寻，生物通姑且在这里抛砖引玉，罗列一些吧。这一part很闷的。
DNA转染后，转入基因的表达可以在1－4天内检测到——仅有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并最终输出mRNA到细胞质进行蛋白合成。几天内，大部分外源DNA会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了。因此转染也可以分为瞬时转染和稳定转染。瞬时转染（transient transfection）指的是转染的核酸不整合到染色体上，结果是短暂的高水平表达，可在24—96小时内检测表达效果，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少，但因为DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，不长久也不稳定。超螺旋质粒转染更倾向于瞬时表达。瞬时表达适合研究启动子等调控元件——不过，诱导型的启动子除外。稳定转染，就是转染的质粒DNA整合到染色体上，或者相当于附加子（episome）可持续存在，使得转染的细胞可长期表达。外源基因整合的几率很小，要获得稳定转染的细胞株，通常需要有筛选标记（比如抗性基因）共同转染，通过选择压力维持表达的稳定——不行的统统枪毙了。质粒整合到染色体上本来就是件稀罕事儿，平均万分之一的几率，如果是线性化DNA转染，那整合的几率就高多了。不过怎么整合也就是一个或者有限的几个拷贝，所以表达量往往比较不高的。但是，“压倒一切的是'稳定'”，很多时候，转染后往往要进行稳定表达的筛选。
成功转染第一步：细胞培养注意事项
细胞系的选择通常不是我们说了算的。有时是实验的需要，有时是实验室条件的限制。如果有选择的余地当然挑个容易做的。越是接近体内的真实情况的原代细胞，通常越是难于伺候。反之亦然。此外细胞本身的特性也是需要考虑的因素。有时需要根据细胞系来选择合适的转染方法；而有时一些启动子在不同的细胞系中表现的功能也不同。这些都是设计实验时需要考虑的因素，姑且不论。不过因为受限于特定的细胞，如何选择合适的转染方法就值得考究了。因为不同的细胞可能适用不同的转染试剂和转染条件。如果实验室已经建立了全套方法，照做可也。如果是个新来的细胞株，最好查查资料看哪些成功转染案例。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，看看其中是否有你的新对手——这个FuGENE 6 比较有优势，已有750多种细胞系成功转染的资料可供参考。生物通的聚焦转染专辑里面也一一列出查阅各主流转染试剂相关数据的网址。当然这只是参考而已，细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。
当实验进行到转染这一步时需要注意的因素有哪些呢？
一、健康而茁壮成长的细胞
转染前细胞最好经过1—2次传代，以保证细胞生长旺盛，容易转染。注意，贴壁细胞生长到几乎汇片时就要赶快进行下一次传代，千万不要使细胞保持融合超过24小时，因为一旦长满了，细胞们就“故步自封”不思转染啦。活力充沛的年轻细胞更容易接受外来的新鲜事物嘛。
大多数已建立的细胞系都是非整倍体，细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化，这会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。比如，新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率（融化细胞的进一步传代不会马上降低转染效率）。因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。
二、恰到好处的铺板密度
转染时的细胞密度对转染效率影响非常显著。不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂，最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法，包括适当的接种量和培养时间等等。一般转染时贴壁细胞密度为40%-80%，但这个需要参考所选转染试剂的说明书——阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数，有的要求细胞90%汇片；而有些多胺或者非脂质体的配方则要求在40%—80%之间，总之是尽量在细胞最适的生理状态下转染，以求最佳的转染效果。
不同的实验目的也会影响转染时的铺板密度，比如研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因，就需要较低的铺板密度，所以需要选择能够在较低铺板密度下进行转染的试剂。需要特别注意。
三、温暖舒适的培养基
健康的细胞培养是一切成功转染的基础。不同的细胞类型有不同的特性，需要特定的培养基、血清、补充添加剂等等。如果是培养新手，可留意随后的生物通细胞培养专辑，我们就不罗嗦了。还是专心介绍几种添加剂在转染过程中“影响因子”吧。
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血清
血清一度曾被认为会降低转染效率，老一代的转染方法往往要求转染前后洗细胞或者在无血清培养基条件下转染，对于某些对血清要求敏感的细胞来说是个难题。不过转染产品配方几经革新后的今天，对于主流的转染试剂来说，血清的存在已经不会影响转染效率，甚至还有助于提高转染效率，比如FuGENE6、Effectene和GeneJuice等。对于多数可以在有血清条件下工作的转染试剂来说，血清的存在会影响DNA—转染复合物的形成，但只要在DNA-转染复合物形成时用无血清培养基来稀释DNA和转染试剂就可以了，在转染过程中是可以使用血清的。这些方便好用、可在有血清条件下转染的试剂包括前面介绍的Lipofectamine2000，FuGENE 6，GeneJuice，Effectene，Polyfect等等。最厉害的是Qiagen的2个产品，Polyfect和Effectene，全程都可以用有血清和抗生素等添加剂的完全培养基来操作，包括稀释步骤，不用担心培养基的变化对细胞生长有什么不良影响了。这样，就不再需要在转染前多次洗细胞，也就减少操作的复杂程度，更重要的是不必再让细胞处于无血清的“悲惨环境”中转染，不必担心对血清缺乏很敏感的细胞受到不必要的麻烦了。娇贵的细胞们，你们有福了。不过要特别注意：对于RNA转染，如何消除血清中潜在的RNase污染是值得关注的。所以血清的质量也是需要关注的。新加培养基的预热对细胞转染很有帮助。
抗生素
支原体、细菌、真菌污染，无论对于细胞培养或者转染都是“不堪回首的痛”，可能会严重影响转染结果，细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染。但是这些添加剂可能对转染造成麻烦。比如青霉素和链霉素，就是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这可能间接导致细胞死亡，造成转染效率低。所以，对于选择Lipofectamine2000系列转染试剂的实验，要特别注意在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。这里又要表扬Qiagen的2个产品，Polyfect和Effectene，因为全程都可以用有血清和抗生素等添加剂的完全培养基来操作，很方便的。对于筛选稳定表达株，要预留足够的时间让抗性基因表达后再添加筛选压力。
其他添加物如抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖这些物质的存在可能会干扰DNA和转染试剂形成复合物的过程，要尽量避免。待续，特别Tips:质粒转染注意事项
此文转载来源：生物通
