小GTP酶中的Ras超家族作为分子开关，控制了多个真核细胞行为，包括细胞生长、分化和运动。因此，小GTP酶参与了一些疾病状态，如癌症和代谢疾病。与GTP结合时，GTP酶激活，而与GDP结合时，GTP酶失活。

为研究GTP酶的激活，赛默飞世尔科技公司推出了Pierce Active GTPase Pull-down and Detection Kit，可优先富集活性形式的GTP酶。这些试剂盒包含了GST-蛋白结合结构域融合，分别是活性Rho、Ras、Rac1、Cdc42、Rap1、Arf1或Arf6选择性的。

      活性小GTP酶很难检测，因为目前还没有此种形式对应的一抗。为了克服这个问题，pull-down方法利用了特定GTP酶的活性形式与已知下游效应蛋白的亲和力。下游效应蛋白的蛋白结合结构域（PBD）以GST融合蛋白的形式表达。当固定在谷胱甘肽琼脂糖树脂上时，PBD将与细胞裂解液中活性GTP酶相结合。pull-down的活性GTP酶可通过Western blotting检测。

      这种亲和力提供了一种方法，从GTP酶的整体变化中区分瞬时上调或下调的活性GTP酶。这些瞬时的变化可能是因为细胞暴露在细胞因子或其他小分子刺激物或抑制剂中，也可能是因为细胞生长、分化、癌变和转移中发生的变化。

      作为对照，细胞裂解液可用GTPγS处理，这是一种GTP的非水解类似物。此方法能捕获所有活性形式的GTP酶，实现GTP酶的大量富集。同时，细胞裂解液可用过量GDP处理，将大部分GTP酶转变成非活性状态，来作为阴性对照。

      试剂盒经过功能验证，与小鼠、大鼠和人的多种细胞类型兼容，其中优化的试剂、特异抗体和Western blot的步骤确保了准确的控制和半定量的结果。此外，您无需自己表达和纯化GST-PBD融合蛋白，也无需使用昂贵的免疫沉淀亲和树脂。此试剂盒操作简单，能在2小时内完成。而微量离心柱能高效分离液体和树脂，避免样品损失和交叉污染。

      该试剂盒包含了亲和纯化的试剂及对照，一个兼容的细胞裂解缓冲液，及最终Western blot检测的特异一抗，足够开展30次pull-down。

此文转载来源：生物通