培养细胞可用各种方法染色,有一般和特殊之分;一般染色为观察细胞一般形态之用,特殊染色为用于观察细胞的特殊成分和结构的染色方法。
Giemsa染色法
实验方法原理 Giemsa 染色是最常用的方法之一,它简便、快速,适用于多种细胞和染色体染色。
试剂、试剂盒 Giemse甘油甲醇Sorensen
仪器、耗材 滴管玻璃片
实验步骤
1. 染液制备
(1)称Giemse粉0.5 g、甘油22 ml,在研钵内先用少量甘油与Giemsa充分混合,研磨至无颗粒;
(2)再将剩余甘油混在一起;56 ℃保温2 小时后,加入33 ml纯甲醇,保存于棕色瓶内。
2. 染色步骤(以盖片培养法或涂片法为例)
(1)用pH6.8~7.38的Sorensen缓冲液,按1:9 比例取Giemsa染液和Sorensen缓冲液混合配成染色液;
(2)细胞标本用甲醇固定10 分钟,或1:3醋酸/甲醇固定30 分钟,用滴管把染色液布满玻片上(注意不要有气泡,用染色缸染色亦可);
(3)染10~15 分钟后,用自来水冲去玻片上多余的染料,空气干燥、二甲苯透明、光学树脂胶封固。
3. 结果
胞核染成紫红色或蓝紫色,胞浆染成粉红色。
注意事项
1. 染色液宜现用现配,保存时间最好不超过48 小时,旧染液染色效果不好。
2. Giemsa 对pH 极敏感,缓冲液pH 值要调准确,否则染色效果不好。
3. 用染色缸染色时,随染色时间的延长,在染液表面常形成一层氧化膜(发亮),这层氧化膜易附在片上形成污秽,且不易除掉。因此在用染色缸染色,尤其用的不是现配者时,染色前应先用小片滤纸刮除液面的氧化层再进行染色。
4. 染色完毕,应把标本浸入水中洗除染液,或用自来水直接冲掉多余染液。
苏木精伊红染色法
实验材料 苏木精
试剂、试剂盒 甘油冰醋酸伊红铵矾
仪器、耗材 载玻片盖玻片
实验步骤
1. 37 ℃温BSS漂洗3 次,每次20 秒~1 分钟;中性福尔马林固定30 分钟;
2. 先用蒸馏水漂洗1 次;再用蒸馏水稀释的苏木精液(1/20)染10 分钟;
3. 自来水洗、置入1 %NaHCO3液中漂洗至蓝紫色;
4. 伊红水溶液中染30 秒~1 分钟;
5. 蒸馏水洗,迅速通过丙酮2 次,每次3~5 分钟;
6. 通过2:1 丙酮/二甲苯3 次,每次1~2 分钟;
Feulgen染色法
本方法中酸的离解根重要,若温度过低、或酸度不够,醛基暴露不充分,染色会过浅;反之,酸解过分,能导致DNA完全解聚,而染色体的染色反应减弱。细胞中RNA对酸比较稳定,醛基难游离,不被着色,为DNA特异性染色的原因。
试剂、试剂盒 HClSchiff亚硫酸钠品红
仪器、耗材 棕色瓶
实验步骤
1. 单层盖片法培养细胞,Carnoy或醋酸/甲醇固定20 分钟;
2. 投入1 N HCl 1~2 分钟(室温);
3. 投入1 N HCl 8~10 分钟(60 ℃);
4. 投入Schiff剂中染色1~5 小时(10 ℃暗处);
5. 漂洗液洗2 次,每次2 分钟;
6. 蒸馏水漂洗2 次,每次3 分钟;
7. 脱水
75 %→100 %酒精;
8. 透明
二甲苯2 次,每次3 分钟;
9. 封片
把盖片置于载物片上(细胞面向上),滴树胶少许,再加较大盖片覆盖;
10. 盖片上加微型重物加压,置数日,树胶干后观察。
镜下观察可见,细胞核染成粉红色至紫红色,胞质无色(为观察DNA,胞质可不必复染)。
吖啶橙染色荧光观察法
实验方法原理 吖啶橙(Acridine Oringe:AO)是一种常用荧光染料,用于直接染色观察活细胞或固定染色观察细胞均可。吖啶橙对DNA和RNA都能染色,快速、简便和有一定的特异性。吖啶橙对活细胞毒性小,配成2×10-4~1×10-4 可用于直接染色观察法更好。
实验材料 细胞
试剂、试剂盒 酒精PBSCaCl2醋酸
实验步骤
1. 用盖片单层培养细胞,从瓶中取出后速用温Hanks液漂洗3~5 秒,以去除培养基中血清(于此步可进行直接染色观察活细胞);
2. 投入95 %酒精或醋酸/甲醇固定15~30 分钟,微干(盖片边缘接触滤纸);
3. 1 %醋酸作用30 秒;
4. 1×10-4 吖啶橙染30 秒或1 分钟;
5. 0.1 M CaCl2处理30 秒~2 分钟;
6. PBS漂洗3 次,每次数秒;
7. PBS封片,荧光显微镜下直接观察并拍照。
注意事项
1. 观察中应随时填加PBS以避免标本干涸:如用油浸镜观察,需再覆以大盖片盖在附有细胞盖片上(细胞面朝上),用无荧光性油浸观察。
2. 标本在95 %酒精中能保存数日后仍可观察,如退色,再用AO染色。镜下观察,DNA呈翠绿色,RNA呈火红色 。
推荐:Nature子刊上的akt pathway的信号通路图
来源:百度学术