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培养细胞的染色实验

培养细胞可用各种方法染色,有一般和特殊之分;一般染色为观察细胞一般形态之用,特殊染色为用于观察细胞的特殊成分和结构的染色方法。

Giemsa染色法


实验方法原理    Giemsa 染色是最常用的方法之一,它简便、快速,适用于多种细胞和染色体染色。


试剂、试剂盒     Giemse甘油甲醇Sorensen


仪器、耗材     滴管玻璃片


实验步骤


1.  染液制备


(1)称Giemse粉0.5 g、甘油22 ml,在研钵内先用少量甘油与Giemsa充分混合,研磨至无颗粒;

(2)再将剩余甘油混在一起;56 ℃保温2 小时后,加入33 ml纯甲醇,保存于棕色瓶内。

2.  染色步骤(以盖片培养法或涂片法为例)

(1)用pH6.8~7.38的Sorensen缓冲液,按1:9 比例取Giemsa染液和Sorensen缓冲液混合配成染色液;

(2)细胞标本用甲醇固定10 分钟,或1:3醋酸/甲醇固定30 分钟,用滴管把染色液布满玻片上(注意不要有气泡,用染色缸染色亦可);

(3)染10~15 分钟后,用自来水冲去玻片上多余的染料,空气干燥、二甲苯透明、光学树脂胶封固。

3.  结果

胞核染成紫红色或蓝紫色,胞浆染成粉红色。



注意事项


1.  染色液宜现用现配,保存时间最好不超过48 小时,旧染液染色效果不好。


2.  Giemsa 对pH 极敏感,缓冲液pH 值要调准确,否则染色效果不好。

3.  用染色缸染色时,随染色时间的延长,在染液表面常形成一层氧化膜(发亮),这层氧化膜易附在片上形成污秽,且不易除掉。因此在用染色缸染色,尤其用的不是现配者时,染色前应先用小片滤纸刮除液面的氧化层再进行染色。

4.  染色完毕,应把标本浸入水中洗除染液,或用自来水直接冲掉多余染液。

苏木精伊红染色法


实验材料         苏木精


试剂、试剂盒        甘油冰醋酸伊红铵矾


仪器、耗材       载玻片盖玻片


实验步骤


1.  37 ℃温BSS漂洗3 次,每次20 秒~1 分钟;中性福尔马林固定30 分钟;


2.  先用蒸馏水漂洗1 次;再用蒸馏水稀释的苏木精液(1/20)染10 分钟;

3.  自来水洗、置入1 %NaHCO3液中漂洗至蓝紫色;

4.  伊红水溶液中染30 秒~1 分钟;

5.  蒸馏水洗,迅速通过丙酮2 次,每次3~5 分钟;

6.  通过2:1 丙酮/二甲苯3 次,每次1~2 分钟;


Feulgen染色法


实验方法原理 此染色法为Feulgen早在1924年提出的一种鉴别细胞中DNA的组织化学方法。细胞中的DNA在60 ℃用1 N HCl酸解离脱氧核糖核酸,使嘌呤碱基与糖苷犍破坏,嘌呤碱脱掉,脱氧核糖的中的醛基游离;醛基能与Schiff试剂相结合,形成一种紫色的复合物。

本方法中酸的离解根重要,若温度过低、或酸度不够,醛基暴露不充分,染色会过浅;反之,酸解过分,能导致DNA完全解聚,而染色体的染色反应减弱。细胞中RNA对酸比较稳定,醛基难游离,不被着色,为DNA特异性染色的原因。

试剂、试剂盒 HClSchiff亚硫酸钠品红


仪器、耗材 棕色瓶


实验步骤


1.  单层盖片法培养细胞,Carnoy或醋酸/甲醇固定20 分钟;


2.  投入1 N HCl 1~2 分钟(室温);

3.  投入1 N HCl 8~10 分钟(60 ℃);

4.  投入Schiff剂中染色1~5 小时(10 ℃暗处);

5.  漂洗液洗2 次,每次2 分钟;

6.  蒸馏水漂洗2 次,每次3 分钟;

7.  脱水

75 %→100 %酒精;

8.  透明

二甲苯2 次,每次3 分钟;

9.  封片

把盖片置于载物片上(细胞面向上),滴树胶少许,再加较大盖片覆盖;

10.  盖片上加微型重物加压,置数日,树胶干后观察。

镜下观察可见,细胞核染成粉红色至紫红色,胞质无色(为观察DNA,胞质可不必复染)。

吖啶橙染色荧光观察法


实验方法原理    吖啶橙(Acridine Oringe:AO)是一种常用荧光染料,用于直接染色观察活细胞或固定染色观察细胞均可。吖啶橙对DNA和RNA都能染色,快速、简便和有一定的特异性。吖啶橙对活细胞毒性小,配成2×10-4~1×10-4 可用于直接染色观察法更好。


实验材料     细胞


试剂、试剂盒     酒精PBSCaCl2醋酸


实验步骤


1.  用盖片单层培养细胞,从瓶中取出后速用温Hanks液漂洗3~5 秒,以去除培养基中血清(于此步可进行直接染色观察活细胞);


2.  投入95 %酒精或醋酸/甲醇固定15~30 分钟,微干(盖片边缘接触滤纸);

3.  1 %醋酸作用30 秒;

4.  1×10-4 吖啶橙染30 秒或1 分钟;

5.  0.1 M CaCl2处理30 秒~2 分钟;

6.  PBS漂洗3 次,每次数秒;

7.  PBS封片,荧光显微镜下直接观察并拍照。


注意事项


1.  观察中应随时填加PBS以避免标本干涸:如用油浸镜观察,需再覆以大盖片盖在附有细胞盖片上(细胞面朝上),用无荧光性油浸观察。


2.  标本在95 %酒精中能保存数日后仍可观察,如退色,再用AO染色。镜下观察,DNA呈翠绿色,RNA呈火红色 。


推荐:Nature子刊上的akt pathway的信号通路图

来源:百度学术

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