免疫印迹与免疫检测实验
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2017-03-08
免疫印迹（常称之为Western印迹），可用于检测单克隆或多克隆抗体识别的抗原。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1. 制备抗原样品，并用小型或标准尺寸的单向或双向凝胶分离蛋白，在一个或多个泳道中分离预染色或生物素酰化的蛋白质分子量标准。
2. 电泳完成后，拆卸凝胶夹层，去除积层胶。以适量的转移缓冲液室温平衡凝胶30 min。
3. 将转移盒放入一个较大的托盘中，加入足量的能盖没整个转移盒的转移缓冲液。
4. 在塑料转移盒的底边，依次将下面物品组装转印夹层垫或海绵，一张剪切得如凝胶大小的滤纸，并预先以转移缓冲液湿润凝胶，用一试管或玻璃棒在凝胶表面缓慢滚动，以排去凝胶和滤纸间的气泡。
2. 电泳完成后，拆卸凝胶夹层，去除积层胶。以适量的转移缓冲液室温平衡凝胶30 min。
3. 将转移盒放入一个较大的托盘中，加入足量的能盖没整个转移盒的转移缓冲液。
4. 在塑料转移盒的底边，依次将下面物品组装转印夹层垫或海绵，一张剪切得如凝胶大小的滤纸，并预先以转移缓冲液湿润凝胶，用一试管或玻璃棒在凝胶表面缓慢滚动，以排去凝胶和滤纸间的气泡。
图一、利用转印槽进行免疫印迹
5. 准备转印膜，按凝胶大小但各边都比凝胶大约1 mm 剪膜。成45。地慢慢将凝胶放入蒸馏水中，水将会渗进膜中并润湿整个表面。然后在转移缓冲液中平衡10~15 min，PVDF膜短暂地在100%甲醇中放一下，然后在转移缓冲液中平衡10~15 min。
6. 用转移缓冲液湿润凝胶表面，直接将已润湿的膜放在凝胶顶部，排去气泡。
6. 用转移缓冲液湿润凝胶表面，直接将已润湿的膜放在凝胶顶部，排去气泡。
7. 润湿另一张Whatman 3MM 滤纸，并置于膜的阳极面，排去所有气泡，在滤纸的顶部放另一块Scotch-Brite垫或海绵。
8. 将转移盒顶部的半面放置适当，扣紧，完成组装。
9. 往转移槽中加入转移缓冲液，按正确的极性方向将转移盒放进电转仪中，连接电源。
10. 在冷却条件下100 V 电转30~60 min，或在冷室中14 V 电转过夜，
11. 关电源，拆卸转印装置，取出转印膜，并在膜上剪一小角或用软性铅笔或Paper-Mate笔作上标记定位。
11. 关电源，拆卸转印装置，取出转印膜，并在膜上剪一小角或用软性铅笔或Paper-Mate笔作上标记定位。
12. 凝胶用考马斯亮蓝染色以确定转移效率。需要时，也可将硝酸纤维素膜或PVDF膜以辅助方案提供的可逆染色方法使蛋白质显迹，也可用如考马斯亮蓝、印度墨墨汁、萘酚蓝或胶体金不可逆染色。
13. 进行蛋白质的免疫杂交和显迹。
此文转载来源：丁香通
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