实验方法原理

      在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度(mg/ml 或U/ml)。

实验材料

      马抗人 IgG 血清

试剂、试剂盒

      离子琼脂   生理盐水琼脂   PBS   标准参考蛋白

仪器、耗材

      微量加样器   打孔器   湿盒   琼脂板   纱布   泡沫塑料

实验步骤

一、实验材料

      2%离子琼脂或生理盐水琼脂（内含2%NaN3）。

      标准马抗人 IgG 血清（抗体）（北京生物制品研究所生产）

      工作标准参考蛋白（北京生物制品研究所生产）

      pH7.2 PBS

      打孔器（孔径3 mm）及打孔模板

      微量加样器

      湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料）

      已制备好的含有 1%马抗人IgG 抗体的琼脂板

      1/50 稀释的单人份待检血清标本

二、实验方法

1、标准曲线的制备

     （1）按照玻片的大小，准备制做琼脂板所需要的1%离子琼脂。首先分装其1/2 量的2%盐水琼脂，例如，用普通载玻片制做时需1%离子琼脂4 ml，在分装2%盐水琼脂时即为2 ml。溶化后置56°C~60°C 水浴中平衡温度备用。

     （2）稀释抗体，用pH7.2 的PBS 稀释标准抗人IgG 抗体，终浓度为抗体效价的一倍。例如，血清效价为1/140，原浓血清即应按1/70 稀释。并分装试管，其分装量应与2%盐水琼脂量相等。

     （3）制备琼脂板：将已稀释的抗人IgG 抗体于56°C 水浴中预热约半分钟，再倾注于已溶化并维持56°C~60°C 的2%盐水琼脂管中，用拇指将管口堵紧。翻转试管1-2 次，将抗体与琼脂混合均匀（注意：抗体与琼脂混合时切勿产生气泡），即刻倾注于玻片上，待凝固后即可。

      （4）打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔5 个，孔距10 mm。

      （5）稀释不同浓度的标准参考蛋白（工作标准）：应根据制品说明进行稀释，例如：工作标准中免疫球蛋白含量，IgG 为100 单位/ml，80.4 微克/单位，其稀释范围为1/10、1/20、1/40、1/80 及1/160。

      （6）加样：将已稀释的不同浓度的工作标准蛋白依次用微量加样器每孔加入10 ul。（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头）。

      （7）将加样的琼脂板放湿盒中，置37°C 温箱，24 小时后观察结果。

      （8）用量角规测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量（单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。

2.  人血清中 IgG 正常值的测定

      （1）将已制备好的抗体琼脂板置打孔模板上，每一琼脂板可打孔4 个（孔径3 mm，孔距10 mm）。

      （2）将单位正常人血清用pH7.2 PBS 分别作1/50 稀释。

      （3）用微量加样器分别取1/50 稀释的单人份血清标本10 μl 加入孔中，每份标本应各加两孔。

      （4）作好标记放湿盒中，置37°C 温箱，24 小时后观察结果。

三、实验结果

      测量各份标本的沉淀环直径并记录结果，然后用标准曲线测出每份标本所含IgG 的量（U/ml，），并换算为mg/ml。

单向免疫扩散示意图

      1.  在制做标准曲线时，为尽量减少误差，至少应做两份以上标准板。

      2. 加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头。

                  此文转载：丁香通