试剂、试剂盒

      GTC 抽提缓冲液   稀释缓冲液 β-巯基乙醇   无 RNase 水   20XSSC   0.5XSSC   1XPBS

仪器、耗材

      亲和素-磁珠 (SA-PMP)   生物素标记的 oligo(dT) 探针   磁架   75℃ 水浴   50 ml 无菌 Corex 离心管    15 ml 螺旋盖锥形离心管   TissuemizerDM 或其他同类匀浆器   BeckmanJ2-21 离心机或其他类似设备

实验步骤

一 材料与设备

      1) 亲和素-磁珠 (SA-PMP)

      2)GTC 抽提缓冲液:4moL/I, 异硫氰酸胍，25 mmol/L 柠檬酸钠，pH:7.1

      3) 生物素标记的 oligo(dT) 探针（50pmol/ul)

      4) 稀释缓冲液：6XSSC，lmmol/L Tris-HCl，PH 7.4，lO mmoL/L EDTA，0.25% SDS

      5)β-巯基乙醇 (48.7%)

      6) 无 RNase 水

      7)20XSSC:67.7 g NaCl 和 44.lg 柠檬酸钠溶于 400 ml 去离子水中，用 NaOH 调 pH 至 7.2, 加水至 500 ml 体积，用 0.1% DEPC 处理过夜，高压灭菌

      8)0.5XSSC:  20XSSC 用无 RNase 水稀释而成

      9)1XPBS

      10) 磁架

      11)75℃ 水浴

      12)50 ml 无菌 Corex 离心管

      13)15 ml 螺旋盖锥形离心管

      14)Tissuemizer DM 或其他同类匀浆器

      15)BeckmanJ2-21 离心机或其他类似设备


二 操作方法

      以重量小于 0.125 的组织中 mRNA 的纯化为例, 大量组织和细胞中 mRNA 的纯化可参阅相关产品说明书。

      1) 从冰箱中取出 GTC 抽提液、生物素标记的 oligo(dT) 探针、无 RNA 酶的水及 0.5XSSC, 平衡至室温并预热稀释液至 70℃

      2) 在 50 ml 无菌螺旋盖锥形离心管屮，首先加入 lml 抽提液（抽提/BME 缓冲液）然后再向其中加人 41ulβ-巯基乙醇 (48.7%)，保证β-巯基乙醇的终浓度为 2%。井将装有缓冲液的管子称重并记录。

      3) 尽可能快地取得所需量的组织并放人到装有抽提/BME 缓冲液的管中，使用小匀浆器髙速匀浆组织至无可见组织块。如果无匀浆器，则可将组织快速切碎，液氮冷冻，在装有液氮的研钵中捣碎研磨。将液氮和组织转移到无菌的 50 ml 螺旋盖锥形管中，液氮挥发后，立即加人抽提/BME 缓冲液，使之完全混合

      4) 将含有组织及抽提/BME 缓冲液的骨子称重，减去第 2) 步中的管重并计算组织块的大小。

      5) 参考图 2.1，根椐第 4) 步计算的组织块大小决定生物素标记的 oligo(dT) 探针用量和亲和素-磁珠 (SA-PMP) 用量。

      6) 将 2 ml 预热稀释缓冲液加到无菌管中，加入 41ulβ-巯基乙醇 (48.7%)，终浓度为 1%。将此溶液加至匀浆液中. 完全混合。再加入第 5 步确定的探针，晃动以充分混合，并在 70°C 温育 5 min

      7) 转移匀浆液至一清洁无菌的 15 mlCorex 管屮，室温 12000 g 离心 1Omim

      8) 离心时，轻轻晃动使 SA-PMP 完仝悬浮，将所需量的磁珠转移到一无菌的 50 ml 螺旋盖锥形管中，将此管放置在磁架上。水平放置磁架至磁珠全部聚集在管的一侧。倾斜管子使溶液不流经磁珠表面. 小心倒掉储存液

      9) 用等体积的 0.5XSSC 悬 SA-PMP，用磁架捕捉，按第 8 步倒掉 SSC 溶液。重复洗涤两次后，将 SA-PMP 重悬在初始体积0.5XSSC 中。

      10) 勻浆液离心完成后，小心取出上清，避免吸取沉淀。将已澄清的匀浆液加人含洗涤好的 SAPMP 的管中，翻转混合

      11) 将匀浆液及 SA-PMP 室温孵育用磁架捕捉 SAPMP 至勻浆液淸澈. 按前述方法小心倾去上清液。用一无菌管收集上清液，放在冰上保存直至能肯定 mRNA 已获得令人满意的结合和洗脱

      12) 于 lml0.5XSSC 中宙悬磁珠，再转移到 2 ml 试管中. 用磁架捕获磁珠，小心倾去 SSC，重复洗涤两遍。最后一次洗后要尽可能多地去除 SSC 而不搅动 SA-PMP。

      13) 用 0.5 mL 无核酶的水洗脱 mRNA，轻振试管重悬 SA〜PMP。

      14) 用磁架捕捉 SA-PMP，将洗脱的 RNA 转移到无蔺小离心管中。用无菌水重悬磁珠，保存在冰中直至 mRNA 产量和纯度被确定。

      15) 向洗脱液中加入 0.1 倍体积的 NaAc（用于 cDNA 克隆) 或 KAc(用于体外翻译) 和 1 倍体积的异丙醇，放置过夜。

      16) 于 12000 g 离心 lOmin，用 lml70?% 乙醇重悬 RNA 沉淀 T 再离心

      17) 真空干燥沉淀 15 min 用无 RNase 的去离子水溶解沉淀。

注意事项

      1)β-巯基乙醇具冇较大毒性，应在通风橱中配制并配戴合适的防护设备。

      2) 洗脱液中可能有残存磁珠，于 12OOOg 离心 lmin, 上清转移至一新管中. 不过，残存的磁珠不会抑制 RNA 使用中所用的大多数常规酶反应并且它们常常有助于沉淀后的沉淀物定位。

此文转载：丁香通