细胞质RNA提取实验
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2017-03-04
由于RNA的种类来源很多，因而提取制备方法各异，一般有苯酚法，去污剂法和盐酸胍法，其中苯酚法实验室最常用。组织匀浆后用苯酚处理离心，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，向水相加冷乙醇后， RNA即以白色絮状沉淀析出。此法较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的RNA。
实验材料
试剂、试剂盒
PBS 细胞裂解液 SDS 蛋白酶K 酚 氯仿 异戊醇 无水乙醇
仪器、耗材
实验步骤
1. 对于单层培奍细胞
（1）每10 cm 培养皿培养的细胞，用冰冷PBS洗涤3次。
（2）每次1 ml 然后用小体积PBS刮下细胞，转移至冰浴的离心管中。
（3）300 g 离心5 min，弃上清，继续冰浴。
2. 对于悬浮培养细胞
（1）300 g 离心5 min，弃上请。
（2）细胞以1/2原体积的冰冷重悬，再离心后弃上清。
3. 重悬细胞于375 μl 冰冷的细胞裂解缓冲液，并置冰浴5 min。
4. 于4℃在微量离心机中离心2 min，将上清移至一个洁净的已加有5 μl 20%SDS的管中，立即在旋涡混合器上振荡。
5. 加入2.5 μl 20 mg/ml 蛋白酶K，37℃温育15 min。
6. 加入400 μl 酚/氯仿/异戊醇抽提，在旋涡混合器上振荡用微量离心机离心，上清移至干净的离心管中，重复抽提1遍。
7. 再以400 μl 氯仿/异戊醇抽棰，上层水相转移至干净的离心管中。
8. 加入40 μl 3 mol/l 乙酸钠缓冲液（pH7.5），再加无水乙醇，混匀后在干冰/乙醇中沉淀15~30 min或-20℃过夜。
8. 加入40 μl 3 mol/l 乙酸钠缓冲液（pH7.5），再加无水乙醇，混匀后在干冰/乙醇中沉淀15~30 min或-20℃过夜。
9. 用微量离心机4℃离心15 min 加人1 ml 75%乙醇/25% 0.1 mol/l乙酸钠（pH5.2）冼涤沉淀。
10. 干燥后用100 μl 处理过的水重溶沉淀，取10 μl RNA稀释于1 ml 水中，测A280和A260，其与的RNA可在-70℃贮存。
此文转载：丁香通
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