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总RNA提取实验
实验方法原理
一些公司推出的总RNA 提取试剂盒,可以用来制备高质量的可用于建库的RNA 。该总RNA 纯化系统采用两种著名的RNA 酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和β-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA 的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA 与蛋白质分离,并将RNA 释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA ,则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA 进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA 可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA 沉淀复溶于GTC溶液中,接着用异丙醇进行二次沉淀,随后用乙醇洗涤沉淀,即可去除所有残留的蛋白质和无机盐,而RNA 中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。
实验材料: 微生物  动物细胞  植物组织
试剂、试剂盒 : RNA 提取试剂盒  焦碳酸二乙酯  乙醇
仪器、耗材: 恒温水  浴冷冻高速离心机  紫外分光光度计  取液器  电泳仪  电泳槽
实验步骤
一、细胞或组织破碎
 
1.  微生物材料
 
(1)发酵3~4天(或对数生长期)的菌体,离心收集菌丝体(动植物材料无需此步处理)。
 
(2)用经DEPC处理的水洗菌丝体2~3次,并尽量除去残存的水。
 
(3)加液氮充分研磨,使其成为粉末,以释放RNA。
 
(4)研磨后的样品转移至12 ml 变性液的容器中匀浆。
 
2.  动植物细胞培养材料 (适用的样品量为细胞:108)
 
(1)细胞或组织培养:按常规方法进行。
 
(2)深层悬浮培养细胞的破碎。
 
①细胞收集:含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中,4℃,3 000 g 离心5分钟。
 
②细胞洗涤:上步沉淀用25 ml 灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤,然后4℃,3 000 g 离心5分钟。
 
③细胞破碎:在沉淀细胞中加入15 ml 预冷的变性液,用无菌处理过的匀浆器匀浆。
 
3.  表面培养细胞的破碎
 
(1)确定培养瓶数量,使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108。
 
(2)细胞收集:将培养液倒掉,用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次,在培养瓶中加入8 ml 预冷变性液。

(3)转动培养瓶,使细胞溶解,此时可见粘度加大。
 
(4)用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶,旋转,溶解细胞,再吸入第三个培养瓶,以此类推。

(5)直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次,然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液,将所有培养瓶洗一次。
 
(6)将上述12 ml 含细胞的变性液转移至一50 ml 无菌离心管中,匀浆破碎细胞。
 
4.  植物组织破碎 (适用的样品量为0.05 g 组织)
 
(1)将600 ul 变性液置于1.5 ml 离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟。
 
(2)将0.05 g 新鲜组织用液氮冰冻。
 
(3)在液氮下,研磨组织块。
 
(4)待液氮挥发后,将上述分散的组织转移至无菌离心管中。
 
5.  动物组织破碎 (适用的样品量为1 g 组织)
 
(1)将12 ml 变性液置于50 ml 离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟。
 
(2)在上述管中加入1 g 新鲜或冰冻动物组织,匀浆粉碎。
 
二、RNA 的抽提
 
1.  在经变性液匀浆的细胞或组织600 ul+60 ul pH4.0的2 M 乙酸钠彻底混匀,可用漩涡振荡器。
 
2.  600 ul 酚\氯仿\异戊醇(25\24\1),彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。
 
3.  冰裕中10~15分钟,离心,4℃,10 000 g,20分钟。
 
4.  上层水相吸至无菌离心管中加等体积的异丙醇,-70℃,30分钟沉淀RNA。
 
5.  离心4℃,10 000 g,20分钟。
 
6.  沉淀RNA ,冷冻干燥15分钟 , RNA 沉淀重新溶于300 ul 变性液中,可振荡(有时为了帮助溶解,可在65℃加热,但时间应极短)。
 
7.  60 ul pH4.0的2 M 乙酸钠彻底混匀,可用漩涡振荡器。
 
8.  600 ul 酚\氯仿\异戊醇(25\24\1),彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。
 
9.  冰裕中10~15分钟,离心,4℃,10 000 g,20分钟。
 
10.  上层水相吸至无菌离心管中。
 
11.  等体积异丙醇二次沉淀(-70℃,30分钟),75%乙醇洗沉淀,沉淀冷冻干燥。

12.  复溶于去RNA 酶的水中(对于准备长期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25 M,再加入2.5体积的乙醇,-70℃保存。)。

注意事项
1.  研磨组织块用于RNA 提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。

2.  变性液及相应的离心管需预冷。
其他
1.  变性液组成

25 g异硫氰酸胍溶于33 ml CSB(42 mM pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2 mM β-巯基乙醇),65℃溶解,过滤灭菌,4℃预冷。
 
2.  酸性酚配制

55℃时,500 g酚溶入500 ml 50 mM,pH4.0乙酸钠,混匀,静止分层后,去上清,再反复加500 ml 50 mM,pH4.0乙酸钠,直到pH<4.1。
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