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动物RNA提取
实验方法原理
SV Total RNA Isolation System (SV 总RNA 纯化系统)可在1小时内从组织、培养细胞和白细胞中提取纯化完整总RNA,方法简单、快速。该系统以膜为基础,根据组织类型的不同,每次最多可纯化60 mg 组织。系统包含DNase 处理步骤,直接在小离心柱的滤膜上完成,大大降低了会干扰扩增反应的基因组DNA 的污染。纯化中不需使用苯酚: 氯仿抽提及乙醇沉淀,最后RNA 样品中没有DNase 残留。
 实验材料 实验鱼
试剂、试剂盒  : 乙醇  DEPC  SV RNA Lysis Buffer  SV RNA dilution Buffer  SV RNA Wash Solution  Yellow core Buffer  MnCl2  0.09M  DNase Ⅰ  SV DNase Stop Solution  Nuclease-Free water
仪器、耗材 : 台式离心机  恒温水浴锅  分析天平  移液器  一次性注射器  方盘  镊子  手术剪  培养皿  离心管
实验步骤
一、材料准备
 
1 .  材料
实验鱼,购于市场。
 2 .  仪器、用具
台式离心机、恒温水浴锅(70℃)、分析天平、移液器、一次性注射器、方盘、镊子、手术剪、培养皿、1.5 ml离心管。
 3.  试剂
95%的RNase-free乙醇;0.1%DEPC处理水;SV RNA Lysis Buffer;SV RNA dilution Buffer;SV RNA Wash Solution;Yellow core Buffer;MnCl2  ;0.09 M;DNase Ⅰ;SV DNase Stop Solution;Nuclease-Free water。
4.  材料处理
 (1)将培养皿、剪刀、眼科镊灭菌,-20℃预冷。
 
(2) 用泡沫盒盛装碎冰,将培养皿置于冰上,将剪刀、镊子置于培养皿中。
 
(3) 用桶盛装碎冰,加入少量的自来水,用纱布包裹鱼放入桶中。
 
(4)将已麻痹的鱼置于方盘中,用剪于肛门向前及斜向上将腹腔剪开,取出内脏,分离肝脏置于培养皿中。
 
(5) 取1.5 ml的离心管于分析天平上,调零。
 
(6)用镊子取20-30 mg的肝脏组织于1.5 ml的离心管中,称重。
 二、 实验操作
 1.   取约30 mg组织于1.5 ml 离心管中,加入175 μl SV RNA Lysis Buffer,用一次性注射器将组织压碎、反复抽打混匀。
 2.  加350 ul SV RNA Dilution Buffer(蓝色),翻转管子3-4 次混匀,置70℃水浴3 min。
 3.   冰上冷却1-2秒,14 000 rpm离心10 min,上清液移入一新离心管。
 4.  加入200 ul 95%的乙醇,枪头混匀。
 5.  将上述混合液移入Spin Basket Assembly,14 000 rpm离心1 min,弃滤液。
 6.   加入600 μl SV RNA Wash Solution(with ethand added),14 000 rpm离心1 min,弃滤液。
 7.   在一新离心管中配制DNase incubation mix:
       Yellow Core Buffer    40 ul
       MnCl2 0.09M     5 ul
       DNase Ⅰ     5 ul
 8.  将上述50 ul 混合液直接加在Spin Basket的膜上,室温(20-25℃)保育15 min。
 9.   加200 ul SV DNase Stop Solution(with ethand added)至Spin Basket 14 000 rpm,离心1 min。
 10.   加600 ul SV RNA Wash Solution,14 000 rpm离心1 min,弃滤液。
       Yellow core Buffer 40 ul  MnCl2,0.09M 5 μl   DNase I 5 ul
 11.   加250 ul SV RNA Wash Solution,14 000 rpm离心2 min,将Spin Basket转移到一新离心管中。
 12.   加50 ul Nuclease-Free Water 至膜上,14 000 rpm离心1 min,溶解RNA,-20℃保存。
 13.   取5 ul RNA样品,1 %琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。
注意事项
1. 实验室用的普通玻璃制品和塑料制品经常有RNA酶污染,使用前必须于180℃干烤3h以上(玻璃制品)或用氯仿冲洗(塑料制品)。另一种方法是用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃制品和其它用品2h,然后用灭菌水淋洗数次,并于100℃干烤15min。RNA电泳槽需用去污剂洗涤,用水冲洗,乙醇干燥,再浸泡于3%H2O2溶液10min,然后用0.1%DEPC水彻底冲洗电泳槽。灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶,可以不需要处理。
2. 在RNA提取过程中,应戴一次性手套,对接触可能污染的器皿时,应勤换手套。
3. 配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC水在37℃处理12h以上,然后高压灭菌除去残留的DEPC。对不能高压灭菌的试剂,用经DEPC水配制处理过的无菌蒸馏水配制,然后用0.22μm滤膜过滤除菌。
其他
一、RNA提取介绍
通常一个典型的哺乳动物细胞约含有10-5 ug RNA ,其中80%~85%为rRNA(主要是28S、18S和5.8 S、5S四种类型);10%~15%为tRNA和核内小分子RNA。
 这些高峰度的RNA的大小和序列确定,可通过凝胶电泳、密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析(HPLC)分离。相反,占RNA总量1%~5%的为mRNA 。mRNA 虽然大小和核苷酸序列各不相同,从数百至数千碱基不等,但大多数真核细胞mRNA在其3'端均有一寡聚腺苷酸(polyA)组成的尾,其长度一般足以吸附于寡聚脱氧胸苷酸―纤维素[oligo(dT)] ,使得mRNA可以利用亲和层析法分离。这个群体编码了所有由该细胞合成的多肽。研究表明RNA极不稳定,易于降解,而RNA酶几乎无处不在,且特别稳定,故在提取RNA时关键因素是最大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制内源RNA酶的活力,因此,创造一个无RNA酶的环境,严格防止RNA酶污染是成功提取RNA的关键。
 对内源性RNA酶,主要运用RNA酶抑制剂,目前常用的RNA酶抑制剂有:
 ①RNA酶的蛋白质抑制剂(RNasin),它是从人胎盘分离的一种蛋白质,可以与多种RNA酶紧密结合形成非共价结合的复合物,使RNA酶失活。RNA酶的蛋白质抑制剂制品经数次冻融后或放在氧化条件下应弃之不用。RNA酶的蛋白质抑制剂不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译;
 ②氧钒核糖核苷复合物,它是由氧钒离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物,是一种过渡态似物,它能与多种RNA酶结合并高效抑制RNA酶活性。然而氧钒核糖核苷复合物能强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译,因此必须用含0.1%羟基喹啉的苯酚多次抽提以除之;
 ③硅藻土,硅藻土能吸附RNA酶,并且在后续的RNA纯化过程中经离心除去;
 ④异硫氰酸胍,它是强力的蛋白质变性剂,在破坏细胞结构使核酸从细胞核中解离出来的同时也使RNA酶变性失活;
 ⑤焦碳酸二乙酯(DEPC),它是RNA酶强烈抑制剂,但其作用并不是绝对的。DEPC主要用于不能高压灭菌的材料和器皿的RNA酶处理;
 ⑥其它化学试剂,如SDS、尿素等对RNA 酶也有一定的抑制作用。
 对外源性RNA酶主要通过以下几个途径污染RNA制品:
 ①玻璃制品、塑料制品和电泳槽;
 ②研究人员造成的污染;
 ③污染的溶液。
 因此在实验中必须采取下列措施抑制外源性RNA酶:
 ①实验室用的普通玻璃制品和塑料制品经常有RNA酶污染,使用前必须于180℃干烤3h以上(玻璃制品)或用氯仿冲洗(塑料制品)。另一种方法是用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃制品和其它用品2 h,然后用灭菌水淋洗数次,并于100℃干烤15 min。
RNA电泳槽需用去污剂洗涤,用水冲洗,乙醇干燥,再浸泡于3%H2O2溶液10 min,然后用0.1%DEPC水彻底冲洗电泳槽。灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶,可以不需要处理;
 ②在RNA提取过程中,应戴一次性手套,对接触可能污染的器皿时,应勤换手套;
 ③配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC水在37℃处理12 h以上,然后高压灭菌除去残留的DEPC。对不能高压灭菌的试剂,用经DEPC水配制处理过的无菌蒸馏水配制,然后用0.22 um 滤膜过滤除菌。

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