全血 细胞培养 染色体技术常用 试剂 配制

 

一、国内实验室应用试剂配制

 

（一）培养液

 

（1）RPMI1640培养液：称取RPMI培养基9.8g，碳酸氢钠1.9g、青霉素100u/ml，加双蒸水至1000ml，调节 pH7.2～7.4无菌过滤冻存备用。

 

（2）小牛血清商品：成都生物制品厂。

 

（3）植物凝集素（PHA）：自制或成品（重庆药检所）。

 

（4）pH调整液：5%NaHCO 3 溶液高压灭菌（8磅15min），0.1N稀盐酸液100ml。

 

（5）秋水仙素：10mg/ml无菌过滤高压灭菌（8磅10min）。

 

（6）磷酸缓冲液：pH7.4。

 

磷酸氢二钠28.8g(H 2 O)、磷酸二氢钾2.67g(无水)，溶于1000ml双蒸水中，加肝素，终浓度为100u/ml。

 

（7）Giemsa染色液：

 

Giemsa粉剂 1g

 

甘油 66ml

 

    在研钵中，加入少量甘油油仔细研磨然后放甘油全部加磨，60℃温箱中保温2h，冷却后加入甲醇66ml。装入有色瓶中混合待用。染色时用pH7.4磷酸缓冲液稀释10倍，随配随用。

 

（二）固定液

 

（1）甲酸：冰乙酸3：1混合即用。

 

（2）PBS缓冲液配制：

 

NaCl 16g Na 2 HPO 4 (12H 2 O) 5.65g

 

KCl 0.4g KH 2 PO 4 0.4g

 

加双蒸水至1000ml pH7.0。

 

取5%胰酶（生理盐水配制）1ml加入50ml PBS液中（最终浓度为0.025%），4℃冰箱待用。

 

二、 细胞培养 （Bhatl B和McGee JOD,1990）

 

1．完全培养基

 

RPMI 76.0ml

 

胎牛血清 20.0ml

 

植物凝集素 2.0ml

 

抗生素/抗菌素溶液（100×） 1.0ml

 

L-谷氨酰胺（100×） 1.0ml

 

2.BudR(5’-Bromo-2-deoxyuridine, 5’-溴-2-脱氧尿嘧啶)溶解10mg/ml BudR于dH 2 O中，0.2μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃储存，BudR要在柔光（弱光）下操作。

 

3．胸腺嘧啶（Thymidine,Thd）　　按250μg/ml溶解于dH 2 O中，过滤后分装储存于-20℃。

 

4．Colcemid(Sigma) 5.0μg/ml溶于dH 2 O中，过滤后分装储存于-20℃。

 

5．KCl（0.75mol/L）　　溶解560mg于100ml dH 2 O中，新鲜配制37℃保存。

 

6．固定剂　　甲醇冰醋酸按3：1（V/V）混合即可，现用现配，置冰上待用。

 

7．缺口平移试剂盒（Amersham和BRL公司）

 

8．生物素7-dATP(BRL)

 

9.糖原（BRL）

 

10．RNA酶A（Sigma）

 

（1）储备液

 

称取RNA酶A 1g溶于100ml醋酸钠中，置沸水中煮10min，分装后储于-20℃。

 

（2）工作液

 

用储备液按1：100稀释。

 

11．20×SSC

 

NaCl 175g

 

柠檬酸三钠 88g

 

dH 2 O 1000ml

 

固定试剂溶解后，dH 2 O定容至1000ml，调pH至7.4，高压灭菌。

 

12．杂交液（高深度，HMmix）

 

去离子甲酰胺 6.0ml

 

100×Denhardt’s液 1.0ml

 

50%硫酸葡聚糖 2.0ml

 

1%人或鲑精DNA ※

 

20×SSC

 

※：临用前加入，终浓度为100～200μg/ml。

 

该液为高浓度杂交液， 存于4℃。

 

13．PBT液

 

BSA 5%

 

Triston X-100/(PBS) 0.1%

 

注：BSA液用前应用Whatman 3mm滤纸过滤。

 

14．兔抗生物素（α-生物素）单克隆抗体

 

用PBT液1：100稀释。

 

该单抗现可从英国Dako公司购得。

 

15．金（10～20nm）标羊抗兔二抗

 

用PBT液1：50稀释。

 

16．银溶液（Janesen）

 

17.Hoedst 33258（Sigma）

 

储备液（100×）

 

Hoedst染料 5mg

 

甲醇 10ml

 

工作液：用2×SSC 1：100稀释储备液。

此文转载来源：丁香通